CD30 und CD95 gehören zur Superfamilie der Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-) Rezeptoren. Sie werden auf den Tumorzellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms (cHL) und des systemischen bzw. kutanen anaplastischen großzelligen T-Zell-Lymphoms (sALCL bzw. cALCL) exprimiert. Im normalen lymphatischen Gewebe sind lediglich wenige aktivierte Lymphozyten CD30-positiv [1]. Aufgrund seiner nahezu selektiven Expression eignet sich CD30 sehr gut als therapeutische Zielstruktur [2]. Die Kenntnis der Effekte, die durch die CD30-Aktivierung ausgelöst werden, ist allerdings eine weitere Grundvoraussetzung für diese Anwendung.

An sALCL-Zelllinien wurde bereits gezeigt, dass die Ligation des CD30-Rezeptors zum Zellzyklusarrest und zum Überleben der Zelle führt [3, 4]. Über den CD30-Stimulus wird bei sALCL-Zellen sowohl der kanonische als auch der nichtkanonische NF-κB- („nuclear factor kappa B“-) Weg aktiviert. Die Aktivierung des kanonischen NF-κB-Weges ist durch die Degradation des Inhibitors IκBα gekennzeichnet. IκBα hält im unstimulierten Zustand die NF-κB-Untereinheiten p50 und p65 im Zytoplasma. Der CD30-Stimulus führt zur Phosphorylierung, Ubiquitinierung und nachfolgenden proteasomalen Degradation von IκBα, wodurch die Translokation von p50 und p65 in den Zellkern mit entsprechender Genaktivierung erfolgt. CD30-Stimulation führt ferner zur Aktivierung des NIK-vermittelten nichtkanonischen NF-κB-Weges mit Prozessierung von p100 zu p52 [4].

CD95-Stimulation führt bei CD95-responsiven Zellen zur Multimerisierung des Rezeptors und zur Formation eines „todesinduzierenden Signalkomplexes“ (DISC), der das Adapterprotein FADD enthält und über den es zur Autoaktivierung der proapoptotischen Initiator-Caspasen 8 und 10 kommt. Bei der DISC-Formation ist ferner cFLIP beteiligt, ein katalytisch inaktives Procaspase-8/10-Homolog, welches mit Caspase-8 um den Einbau in den DISC kompetitiert und gegen die Apoptoseauslösung wirkt [5]. Es wurden 3 Splice-Varianten von cFLIP identifiziert: cFLIP(long), cFLIP(short) und cFLIP(R). Für alle 3 Formen ist eine antiapoptotische Funktion beschrieben [6]. Die Initiator-Caspasen aktivieren Effektor-Caspasen, insbesondere Caspase-3, die den Abbau einer Vielzahl essenzieller Zellbestandteile vornimmt, was zum Zelltod führt [7].

Viele hämatologische Tumoren sowie sALCL-Zelllinien sind durch CD95-Resistenz gekennzeichnet ([8], und eigene unveröffentlichte Untersuchungen). Im Gegensatz zu den hier analysierten cALCL-Zelllinien können bei sALCL-Zelllinien keine „CD30/CD95-crosstalk-Versuche“ durchgeführt werden, da der CD95-Signalweg blockiert ist.

Ergebnisse

CD30-Stimulation führt in cALCL-Zellen zur NF-κB-Aktivierung und cFLIP-Induktion, CD95-Stimulation löst Caspase-Aktivierung und Apoptose aus

Die Oberflächenexpression von CD30 und CD95 wurde bei den 4 cALCL-Zelllinien (JK, Mac-1, Mac-2A, Mac-2B) durchflusszytometrisch gesichert (Abb. 1 a, Abb. 2 a).

Abb. 1
figure 1

CD30-induzierte Effekte. a Die CD30-Oberflächenexpression der 4 cALCL-Zelllinien (JK, Mac-1, Mac-2A, Mac-2B) wurde durchflusszytometrisch bestimmt. b Die CD30-vermittelte Aktivierung der NF-κB-Wege wurde mittels Immunoblot analysiert. Anhand der Zelllysatanalyse der für 30 min CD30-stimulierten Zellen wurde über die Degradation von IκBα eine Aktivierung des kanonischen NF-κB-Weges nachgewiesen (oberer Teil). Die Analyse der p100/p52-Prozessierung ist im unteren Teil dargestellt und belegt die CD30-induzierte Aktivierung des nichtkanonischen NF-κB-Weges nach 16 Stunden. Die Expression von β-Aktin wird durch CD30 nicht reguliert und dient als endogene Kontrolle. c Die Expression von 4 bekannten CD30-regulierten Genen (cFLIP, TRAF1, cIAP2 und A20) wurde mittels RQ-RT-PCR mit und ohne CD30-Stimulation (16 Stunden) bestimmt. d Die CD30-induzierte cFLIP(long)-Proteinexpression wurde nach 16 stündiger CD30-Stimulation mittels Immunoblot analysiert. (Aus [14], mit freundl. Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Abb. 2
figure 2

CD95-induzierte Effekte. a Die CD95-Oberflächenexpression der 4 cALCL-Zelllinien (JK, Mac-1, Mac-2A, Mac-2B) wurde durchflusszytometrisch bestimmt. b Nach einer 16-stündigen Inkubation mit dem agonistischen CD95-Antikörper CH11 (10 ng/ml) wurde die CD95-induzierte Caspase-3- und Caspase-8-Aktivierung im Immunoblot dargestellt (GAPDH Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase). c Die nach 16-stündiger CD95-Stimulation ausgelöste Apoptose wurde bei den cALCL-Zelllinien duchflusszytometrisch bestimmt. (Aus [14], mit freundl. Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Die CD30-vermittelte Aktivierung von NF-κB wurde mittels Immunoblot analysiert. 30 min CD30-Stimulation führt bei den 4 Linien zur Degradation des NF-κB-Inhibitors IκBα und damit zur Aktivierung des kanonischen NF-κB-Weges (Abb. 1 b, oberer Teil). Die Prozessierung von p100 zu p52 spiegelt die Aktivierung des nichtkanonischen NF-κB-Weges in den 4 cALCL-Zelllinien nach 16-stündiger CD30-Stimulation (Abb. 1 b, unterer Teil) wider. Die Expression von 4 bekannten CD30-regulierten Genen (cFLIP, TRAF1, cIAP2 und A20) wurde mittels RQ-RT-PCR („real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction“) mit und ohne CD30-Stimulation bestimmt. Bei allen 4 Zelllinien konnte eine signifikante CD30-vermittelte Induktion dieser Gene dargestellt werden (Abb. 1 c). Es konnte eine massive cFLIP-Expressionssteigerung auf Proteinebene nach 16-stündiger CD30-Stimulation mittels Immunoblot in den 4 cALCL-Zelllinien nachgeweisen werden (Abb. 1 d).

Die durch CD95-Stimulation vermittelte Caspase-8- und Caspase-3-Aktivierung wurde mithilfe von Immunoblot-Analysen dargestellt. Die Zugabe des CD95-agonistischen CH11-Antikörpers (50 ng/ml) induziert nach 8 Stunden bei den 4 cALCL-Zelllinien eine Caspase-8- und -3-Aktivierung (Abb. 2 b). Die durchflusszytometrische Analyse (Annexin-V/PI) belegt die CD95-induzierte Apoptose (Abb. 2 c).

CD30/CD95-Kostimulation und cFLIP-Inhibition an der cALCL-Zelllinie Mac-2B

Um die intrazellulären Effekte und Auswirkungen der CD30-Stimulation beschreiben zu können, haben wir CD30/CD95-Kostimulationen an der cALCL-Zelllinie Mac-2B durchgeführt. Die Zellen wurden zunächst 16 Stunden CD30-stimuliert, anschließend folgte eine CD95-Stimulation von 8 Stunden. Von den CD30-, CD95- und CD30/CD95-stimulierten Zellen sowie den unstimulierten Kontrollzellen wurden Proteinlysate hergestellt und cFLIP, Caspase-8 und Caspase-3 mittels Immunoblot analysiert. Die GAPDH- (Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-) Expression diente als endogene, nichtregulierte Kontrolle.

Konstitutiv exprimiertes cFLIP (Abb. 3 a, Spur 1) wird im Zuge der 8-stündigen CD95-Stimulation komplett degradiert (Abb. 3 a, Spur 2). Caspase-3 und Caspase-8 werden durch den CD95-Stimulus aktiviert, was durch das Auftreten der 17-kDa-Bande im Falle der Caspase-8 und 17/19-kDa-Banden im Falle der Caspase-3 dargestellt ist (Abb. 3 a, Spur 2). 16 Stunden CD30-Stimulation führt zur signifikanten Expressionssteigerung von cFLIP, ohne dass sich die Caspase-8- oder Caspase-3-Aktivität verändert (Abb. 3 a, Spur 3). Die Kombination von CD30-Stimulation, gefolgt von einer CD95-Stimulation führt dazu, dass cFLIP nicht vollständig degradiert wird, wie es durch alleinige CD95-Stimulation der Fall ist. Die Aktivität der Caspase-8 und Caspase-3 wird deutlich inhibiert (Abb. 3 a, Spur 4).

Die Apoptoseinduktion wurde durchflusszytometrisch bestimmt (Abb. 3 c). Die konstitutive Apoptoserate liegt bei etwa 4%. Der CD95-Stimulus induziert Apoptose, und es werden etwa 37% Annexin-V/PI-positive Zellen gemessen (Abb. 3 b, Spur 2). CD30-Stimulation allein beeinflusst die konstitutive Apoptose nicht (Abb. 3 b, Spur 3). Die Kombination von CD30-Stimulation, gefolgt von der CD95-Stimulation führt zu einer fast vollständigen Inhibition (etwa 7%) der Apoptoserate (Abb. 3 b, Spur 4). Um die Bedeutung der CD30-induzierten cFLIP-Expression zu analysieren, haben wir cFLIP durch den Einsatz lentiviral-basierender shRNA-Technik inhibiert und anschließend Stimulationsexperimente und Analysen wie zuvor bei den nativen Zellen durchgeführt (Abb. 3 b). Die cFLIP(long)-Protein-Expression wird durch cFLIPRNAi signifikant inhibiert und die Immunoblot-Analyse zeigt eine deutlich schwächere cFLIP(long)-Bande als in den Lysaten der mit dem leeren Vektor transfizierten („mock“) und mit nichtfunktioneller RNAi-behandelten Zellen („scrambledRNAi“; Abb. 3 c). Bei den cFLIP-inhibierten, CD30/CD95-stimulierten Zellen, kommt der CD30-vermittelte antiapoptotische Effekt, der bei den nativen Zellen zur Caspase-8- und Caspase-3-Inhibition führt, nicht zum Tragen (Abb. 3 a, Vergleich Spur 4 und 6). Ferner lässt sich die Wiederherstellung der CD95-Sensitivität nach cFLIP-Inhibition gut auf zellulärer Ebene darstellen. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt eine signifikante Induktion von Apoptose nach CD30/CD95-Stimulation, in den cFLIP-inhibierten Zellen (Abb. 3 b, Spur 5).

Abb. 3
figure 3

CD30/CD95-Kostimulation und RNAi-vermittelte Inhibition von cFLIP in der cALCL-Zelllinie Mac-2B. Die cALCL-Zelllinie Mac-2B wurde CD30-, CD95- und CD30/CD95-stimuliert und anschließend mittels Immunoblot und Durchflusszytometrie untersucht. Die Proteinlysate der mit einem isotypspezifischen Kontrollantikörper (IgG3, 500 ng/ml) behandelten Zellen (a, Spur 1), 8 Stunden CD95-stimulierter Zellen (a, Spur 2, CH11 10 ng/ml), 16 Stunden CD30-stimulierter Zellen (a, Spur 3, Ki-1 500 ng/ml) sowie der 16 Stunden CD30-stimulierter und 8 Stunden CD95-stimulierter Zellen (a, Spur 4, Ki-1 500 ng/ml, CH11 10 ng/ml) wurden mittels cFLIP-, Caspase-8-, Caspase-3-, GAPDH-Antikörper analysiert. Die Analyse der GAPDH-Expression diente als endogene Kontrolle. Konstitutiv exprimiertes cFLIP (a, Spur 1) wird durch 8-stündige CD95-Stimulation komplett degradiert (a, Spur 2). 16 Stunden CD30-Stimulation führt zur signifikanten Expressionssteigerung von cFLIP(long) ohne Beeinflussung der Caspase-8 oder -3 (a, Spur 3). Die Kombination von CD30-Stimulation, gefolgt von einer CD95-Stimulation, führt lediglich zu einer partiellen cFLIP-Degradation. Der CD30-Stimulus inhibiert die CD95-vermittelte cFLIP(long)-Degradation (Vergleich a, Spur 2 gegen Spur 4). Unter diesen Bedingungen werden deutlich inhibierte Banden für aktive Caspase-8 und Caspase-3 detektiert (a, Spur 4). Die durchflusszytometrische Analyse der Apoptose ist in b dargestellt. cFLIP wurde durch den Einsatz lentiviral-basierender shRNA-Technik inhibiert und anschließend Stimulationsexperimente und Analysen analog der nativen Zellen durchgeführt. Die Analyse der cFLIP-inhibierten, CD30/CD95-stimulierten Zellen ist in a (Spur 5 und 6) sowie b (Spur 5) wiedergegeben. Ein repräsentativer cFLIP(long) Immunoblot von Kontrollvektor- („mock“; c Spur 1), „scrambledRNAi“- (c Spur 2) und cFLIPRNAi-behandelter Mac-2B Zellen ist dargestellt (c Spur 3). (Aus [14], mit freundl. Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Diskussion

CD30 eignet sich aufgrund seiner relativ selektiven Expression grundsätzlich sehr gut als therapeutische Zielstruktur [2, 9], wobei die Kenntnis der Effekte, die durch CD30-Aktivierung ausgelöst werden, eine Grundvoraussetzung für diese Anwendung ist.

cALCL-Zelllinien zeichnen sich neben CD30-Responsivität durch CD95-Sensitivität aus, d. h. CD95-Stimulation führt über Caspase-8- und Caspase-3-Aktivierung zum Zelltod. Aufgrund dieser Bedingungen waren wir in der Lage „CD30/CD95-cross-talk-Versuche“ an cALCL-Zellen durchführen zu können, was durch die CD95-Resistenz bei sALCL-Zellen nicht möglich ist. Mithilfe des experimentellen Designs der CD30/CD95-Kostimulation von ALCL-Zellen konnten wir CD30-Antikörper-vermittelte antiapoptotische Effekte darstellen, die Relevanz für CD30-Antikörper-basierende therapeutische Konzepte haben.

Unsere Analysen stellen die CD30-induzierte Aktivierung einer antiapoptotischen Signalkaskade in cALCL-Zelllinien dar. Der CD30-Stimulus führt bei cALCL-, analog der sALCL-Zelllinien [4], zur Aktivierung der beiden NF-κB-Wege. CD30-ausgelöste NF-κB-Aktivierung führt zur cFLIP(long)-Induktion, wodurch Resistenz gegenüber CD95-induzierter Apoptose vermittelt wird. Ein Schema dieser CD30-induzierten Effekte ist in Abb. 4 dargestellt. Wir haben uns bei der Immunoblotanalyse auf cFLIP(long) konzentriert, dessen Expression und antiapoptotische Bedeutung in vivo beschrieben ist [6]. An Hodgkin-Zelllinien konnte Mathas et al. den antiapoptotischen Effekt von cFLIP auf das CD95-Signal darstellen [10]. In Hodgkin-Zelllinien ist cFLIP allerdings nicht wie in den hier untersuchten cALCL Zelllinien durch CD30-Ligation zu stimulieren [4].

Abb. 4
figure 4

CD30-induziertes cFLIP inhibiert die CD95-induzierte Apoptose bei cALCL-Zelllinien. Ligation des CD30-Rezeptors durch den CD30-Liganden oder den agonistischen CD30-Antikörper Ki-1 führt zur Multimerisierung der CD30-Rezeptoren. Die Folge ist die Aktivierung des kanonischen NF-κB-Weges. Diese kann über die Degradation des zytoplasmatischen NF-κB-Inhibitors IκBα bestimmt werden. Es kommt ferner zur CD30-vermittelten Initiierung des nichtkanonischen NF-κB-Weges, dessen Aktivierung durch die p100/p52-Prozessierung gekennzeichnet ist. Die NF-κB-Aktivierung führt u. a. zur Expressionssteigerung des antiapoptotisch wirkenden Proteins cFLIP. Erfahren CD30-vorstimulierte Zellen eine CD95-Aktivierung, so wirkt das CD30-induzierte cFLIP inhibierend auf die CD95-induzierbare Apoptose. cFLIP kompetitiert mit Caspase-8 am CD95-Rezeptor und bewirkt sowohl die Inhibition der Initiator-Caspase-8 als auch die Inhibition der exekutierenden Caspase-3. (Aus [14], mit freundl. Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Durch den Einsatz lentiviral-basierender shRNA-Technik konnten wir cFLIP inhibieren und so dessen zentrale Rolle für die CD30-induzierte antiapoptotische Wirkung aufzeigen. Obgleich für cFLIP sowohl pro- als auch antiapoptotische Effekte beschrieben wurden [6, 11], konnten wir unter den Versuchsbedingungen bei den cALCL-Zelllinien lediglich einen antiapoptotischen Effekt, d. h. die Rückführung der CD95-Sensitivität nach cFLIP-Inhibition darstellen.

Die auf der Anwendung von CD30-Antikörpern basierenden therapeutischen Konzepte zur Behandlung CD30-positiver Lymphome ergaben bisher ernüchternde Ergebnisse, wohingegen z. B. Immunotoxin-konjugierte CD30-Antikörper vielversprechendere Resultate lieferten [12]. Unsere Daten zeigen, dass die alleinige CD30-Stimulation keinen therapeutischen Nutzen für cALCL-Zellen vermitteln würde. Interessanterweise führt die Inhibition von NF-κB zur Induktion von CD30-induzierter Apoptose, wie an sALCL- und cHL-Zelllinien gezeigt werden konnte [4, 13].

Fazit: Die Apoptoseresistenzinduktion ist bei der Entwicklung von immuntherapeutischen Ansätzen mit CD30-Antikörpern limitierend. Ihr kann möglicherweise nur durch gleichzeitige pharmakologische Inhibition der NF-κB-Aktivierung begegnet werden.

Material und Methoden

Zellkultur

Die cALCL-Zelllinien JK, Mac-1, Mac-2A und Mac-2B wurden unter Standardbedingungen kultiviert [14].

Rezeptorstimulation

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2×105/ml Medium kultiviert. Nach 24 Stunden wurde für 16 Stunden CD30-stimuliert (Ki-1, 0,5 mg/ml, selbst produziert [4]) bzw. mit dem IgG3-Kontrollantikörper (Sigma, Taufkirchen, Deutschland, FLOPC 21, 0,5 mg/ml) behandelt. Die CD95-Stimulation (CH11, Beckman Coulter, Krefeld, Germany; 10/100 ng/ml) wurde nachfolgend für 8 Stunden durchgeführt. Von den behandelten Zellen wurde RNA und Proteinlysat für RT-PCR und Immunoblot isoliert. Die Bestimmung der apoptotischen und toten Zellen erfolgte mit dem „Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I“ (BD Biosciences Pharmingen, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland). Die Apoptose und die Bestimmung der CD30- und CD95-Expression (Ber-H2, DAKO, Hamburg, Deutschland bzw. CH11) wurde durchflusszytometrisch (FACSort/CellQuest; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) analysiert.

Immunoblotanalyse

Der Immunoblot [4] wurde mit folgenden Antikörpern durchgeführt: monoklonaler cFLIP, GAPDH, IκBα und p52 (G11, 6C5, C-21, C-5, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland), Caspase-3 und Caspase-8 (Asp132 und Asp384, Cell Signaling, Hamburg, Deutschland), β-Aktin (Abcam, Cambridge, England). Die Detektion erfolgte mittels HRP-konjugierter Antikörper und Chemolumineszenz (Amersham, Braunschweig, Deutschland).

RNA-Extraktion und RT-PCR

Die Gesamt-RNA der behandelten Zellen wurde mit dem „RNeasy extraction Kit“ (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert. Die Integrität der RNA wurde mittels Kapillarelektrophorese (Bioanalyzer; Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) bestimmt und die reverse Transkription mit 1 mg RNA, Zufallshexamerprimern und „Multiscribe Reverse Transcriptase“ (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt (10 min bei 25°C, 30 min bei 48°C, 5 min bei 95°C). Die A20-, cIAP1-, cIAP2-, TRAF1- und cFLIP-mRNA wurde mit dem „Real-time PCR Cycler“ (TaqMan, ABI Prism 7000, Applied Biosystems) und SYBR-Green gemessen [4].

Generierung der cFLIP-shRNA-Lentiviren und Transduktion der cALCL-Zelllinie Mac-2B

DNA-Oligonukleotide für beide cFLIP-shRNA-Stränge sowie die „Scrambled-Kontrolle“ wurden synthetisiert (MWG, Ebersberg, Deutschland), hybridisiert und mit HpaI/XhoI-Restriktionsstellen hinter dem U6-Promoter des pLL3.7-Vektors kloniert (Addgene, Cambridge/MA; [15]; cFLIP-shRNA: 5’-GAATAGACCTGAAGACAAATTCAAGAGATTTGTCTTCAGGTCTATTCTTTTTT-3’, „scrambled-shRNA“: 5’-GCAGGAGCTATGCTACCATTTCAAGAGAATGGTAGCATA GCTCCTGCTTTTTT-3‘). Der leere Vektor („mock“) diente als Kontrolle. Die Produktion der replikationsdefizienten Lentiviren und die Transduktion erfolgte wie beschrieben [15]. Die Transduktionseffizienz wurde durch die vektorkodierte Expression des grün-fluoreszierenden Proteins durchflusszytometrisch gemessen. Die cFLIP-Inhibition wurde mittels RT-PCR bestimmt. Gesamt-RNA wurde mit dem „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen) isoliert und die cDNA mit dem „Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads“ (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Schweden) synthetisiert. cFLIP (5’-TGTTGATGCTTTTGACTTTC-3‘ und 5’-ACAGCTTTTCTGTCCATCTT-3) und GAPDH (5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3‘ und 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3‘) wurden amplfiziert (Hybridisierung 55°C/24 Zyklen).

Statistische Analyse

Für statistische Analysen wurde der „Student’s t-test“ eingesetzt. Ein Unterschied von 0,05 zwischen zwei zu prüfenden Proben wurde als signifikant beurteilt.