DE69629296T2

DE69629296T2 - Sauerstoffaktivierbare zusammensetzungen zur desinfection oder sterilisation

Info

Publication number: DE69629296T2
Application number: DE69629296T
Authority: DE
Inventors: C. Robert ALLEN
Original assignee: Exoxemis Inc
Current assignee: Exoxemis Inc
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-05-10
Also published as: CA2222964A1; KR100449283B1; EP0832198A4; US6503507B1; EP0832198B1; CA2222964C; US5756090A; JPH11506444A; US6033662A; ATE246243T1; AU5740196A; AU708557B2; DE69629296D1; EP0832198A1; WO1996038548A1; JP2007051153A; KR19990022188A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Verhüten von Fäulnis, Desinfizieren oder Sterilisieren. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren und Zusammensetzungen, die, solange sie für die Lagerung verpackt sind, inaktiv bleiben, wenn sie jedoch für die Verwendung freigesetzt werden, durch Kontakt mit Luft als antiseptisches, desinfizierendes oder sterilisierendes Mittel aktiv werden.
Hintergrund der Erfindung
Antiseptik wird als eine deutliche Verringerung mikrobieller Inhaltsstoffe definiert, während Desinfektion die Eliminierung aller Lebensformen, die Krankheiten hervorrufen können, ist. Desinfektion bedeutet praktisch die Vernichtung sämtlicher lebensfähiger Mikroorganismen mit Ausnahme von Sporen. Sterilisation bedeutet die vollständige Eliminierung aller lebensfähigen Mikroorganismen einschließlich Sporen (J. V. Bennett, P. S. Brachman (Hrsg.), "Hospital Infections", 2. Aufl., 238–241 (1986)). Geeignete Verfahren der Sterilisation, die derzeit verwendet werden, sind Autoklavierung (mit Dampf unter Druck), trockene Hitze und Gassterilisation (z. B. Ethylenoxid). Das Tränken mit Antiseptika führt normalerweise zu keiner vollständigen Sterilisation und wird nur dann herangezogen, wenn die oben beschriebenen Sterilisationsverfahren nicht angewendet werden können.
Alle der oben beschriebenen Sterilisationsverfahren haben ihre Grenzen. Viele Materialien und Vorrichtungen werden durch Trockenhitze- oder Dampfsterilisation zerstört. Gassterilisation macht ein längeres Kontaktieren, z. B. Einwirkenlassen für mehr als eine Stunde, und einen Zeitraum für die Dissipation des Gases aus dem behandelten Material nach der Sterilisation erforderlich. Instrumente mit Linsen oder poröse Gegenstände müssen vor ihrer Verwendung typischerweise 24 bis 48 Stunden lang Luft ausgesetzt werden. Die Sterilisation mit keimtötenden Mitteln wie Gluteraldehyd (2%), Formaldehyd (8%) – Alkohol (70%) oder Wasserstoffperoxid (6%) erfordert eine Einwirkzeit von 6 bis 18 Stunden. Diese keimtötenden Mittel sind zudem hochgiftig und unterscheiden sich nicht in ihrer toxischen Wirkung. Dadurch können diese Sterilisationsmittel nicht direkt mit Wirtsgewebe in Kontakt gebracht werden und können nur begrenzt als Sterilisationsmittel für biomedizinische Vorrichtungen, wie z. B. Kontaktlinsen, medizinische und chirurgische Instrumente, und zum Reinigen von Wunden verwendet werden. Ein antimikrobielles Mittel, das beispielsweise zum Desinfizieren oder Sterilisieren einer Kontaktlinse eingesetzt wird, muss eine Anzahl an einzigartigen Eigenschaften aufweisen. Einerseits muss es gegen Mikroorganismen wirksam sein, die für das Auge gefährlich sein können. Gleichzeitig muss es vom sensiblen Augenbereich des Kontaktlinsenträgers vertragen werden und darf auch die Kontaktlinse selbst nicht beschädigen. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Kontaktlinsen-Desinfektions- und Aufbewahrungslösungen bekannt. Solche Lösungen verwenden üblicherweise entweder Sorbinsäure, Thimerosal, Chlorhexidin, ein polyquaternäres Germizid, ein synthetisches Antibiotikum oder ein herkömmliches quaternäres Germizid, wie z. B. Bezalkoniumchlorid. Diese herkömmlichen antimikrobiellen Mittel weisen jedoch Nachteile auf, die sie in ihrer Verwendbarkeit einschränken. Sorbinsäure enthält z. B. charakteristischerweise Formaldehyd-Rrückstände, Thimerosal wirkt bei manchen Patienten als Allergie-Sensibilisator, und Chlorhexidin ist relativ giftig. Ein weiters Problem besteht darin, dass weiche Kontaktlinsenmaterialien dazu neigen, antimikrobielle Mittel sowie andere aktive Inhaltsstoffe, die häufig in Kontaklinsen-Pflegelösungen enthalten sind, manchmal sogar bis zu gefährlichen Ausmaßen zu binden und einzudicken. Benzalkoniumchlorid wird z. B. üblicherweise aufgrund seiner Neigung, in die Linsenmatrix aufgenommen zu werden, nicht für weiche Kontaktlinsen verwendet. Zusätzlich sind viele der bis heute bekannten antimikrobiellen Mittel gegen eine Anzahl von Pilzen und Hefen relativ unwirksam, die im Augenbereich Probleme hervorrufen können.
Die WO 91/11105 offenbart antimikrobielle Zusammensetzungen, die Iodid-Anionen, Thiocyanat-Anionen, 1-Glucose und ein Oxidoreduktase-Enzym, Glucose-Oxidase, um fassen. Die US-A-5.389.369 offenbart ein verbessertes System auf Haloperoxidase-Basis zum Abtöten von Bakterien, Hefe- oder Sporen-Mikroorganismen, in dem die Mikroorganismen in Gegenwart eines Peroxids und Chlorids oder Bromids mit einer Haloperoxidase und einer die antimikrobielle Aktivität verstärkenden α-Aminosäure kontaktiert werden. Obwohl festgestellt wurde, dass Zusammensetzungen und Verfahren der US-A-5.389.369 hochwirksame antimikrobielle Mittel sind, müssen die Komponenten getrennt gelagert und aufbewahrt werden, um eine Wechselwirkung von Haloperoxidase und Peroxid sowie ein Aufbrauchen vor der Freisetzung zur Verwendung zu verhindern.
Es besteht daher Bedarf an Verfahren und Zusammensetzungen zum Desinfizieren und/ oder Sterilisieren von Materialien oder Vorrichtungen wie Kontaktlinsen, chirurgischen Instrumenten und anderen biomedizinischen Vorrichtungen, die gegen Bakterien, Pilze und Hefen wirksam sind, für den Anwender verträglich sind, die Vorrichtungen nicht beschädigen und so gestaltet sind, dass sie einfach und bequem gelagert und verwendet werden können. Idealerweise sollten derartige desinfizierenden-sterilisierenden Zusammensetzungen schnell mit minimaler Wirtstoxizität und maximaler keimtötender Wirkung wirken. Die Zusammensetzungen sollten einfach abzugeben sein und das behandelte Material oder die Vorrichtung sowie das Wirtsgewebe, mit dem sie in Kontakt kommen, nicht schädigen. Abhängig von der Stärke der Zusammensetzung und dem Einwirkungszeitraum sollten die Zusammensetzungen eine antiseptische, desinfizierende oder sterilisierende Wirkung hervorrufen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zum Herstellen von durch Luft aktivierbaren, d. h. durch Sauerstoff (O₂) aktivierbaren, desinfizierenden-sterilisierenden Lösungen. Lösungen, die eine Haloperoxidase (d. h. eine Halogenid : Wasserstoffperoxid-(H₂O₂-)Oxidoreduktase, wie z. B. Myeloperoxidase, Eosinophil-Peroxidase oder Lactoperoxidase) zusammen mit einem Halogenid oder einer Kombina tion aus Halogeniden (d. h. Chlorid, Bromid und/oder Iodid) in geeigneten Konzentrationen, eine Oxidase (d. h. eine Substrat : O₂-Oxidoreduktase), die H₂O₂ erzeugen kann, und ein für die Oxidase spezifisches Substrat enthalten, werden unter aeroben Bedingungen getrennt hergestellt, wobei sämtliche der Lösungen in anaerobe Lösungen umgewandelt werden, bevor sie endgültig kombiniert und vermischt werden. Die anaeroben Formulierungen werden in Behälter verteilt, die dazu fähig sind, die anaerobe Bedingung aufrechtzuerhalten (z. B. Druckkanister). Das Abgeben der Lösung zum Zeitpunkt der Verwendung bringt die Formulierung mit Luft (d. h. O₂) in Kontakt, wodurch deren desinfizierenden-sterilisierenden Eigenschaften aktiviert werden. 0₂ ist die geschwindigkeitsbegrenzende Komponente bei der Oxidase-Erzeugung durch H₂O₂. Unter aeroben Bedingungen katalysiert die Oxidase die Oxidation ihres Substrats sowie die Reduktion von O₂, um H₂O₂ zu produzieren. H₂O₂ wiederum dient als Substrat für die Haloperoxidase, die die Oxidation von Halogenid zu unterhalogeniger Säure katalysiert. Unterhalogenige Säure reagiert mit einem zusätzlichen H₂O₂, um ein Singulett-Sauerstoffmolekül (¹O₂) zu erzeugen. Unterhalogenige Säure (z. B. unterchlorige Säure) und insbesondere ¹O₂ sind wirksame mikrobiozide Mittel. Sowohl die Haloperoxidase-Erzeugung von unterhalogeniger Säure als auch deren Verbrauch in der Reaktion, um ¹O₂ zu erzeugen, sind von der Verfügbarkeit von H₂O₂ abhängig. Eine hohe Geschwindigkeit der H₂O₂-Erzeugung führt zu keiner Anhäufung von unterhalogeniger Säure, sondern stattdessen zu einer hohen ¹O₂-Produktion. Die Mikrobiozid-Kapazität und -Toxizität von ¹O₂ wird durch die Halbwertszeit dieses metastabilen, elektronisch angeregten Reaktanden begrenzt, und die desinfizierende-sterilisierende Aktivität ist als solche zeitlich durch die Dynamik der Oxidans-Erzeugung definiert und eingeschränkt. Die desinfizierende-sterilisierende Aktivität einer Formulierung macht das Einwirkenlassen von Luft erforderlich und ist von der Gegenwart der verwendeten Halogenid-Haloperoxidase-Kombination, der Aktivität der vorhandenen Oxidase, der Verfügbarkeit von Oxidasespezifischem Substrat sowie von O₂ abhängig.
Für diese desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen ist O₂ die essentielle und begrenzende Komponente in ihrer Mikrobiozid-Wirkung. Die Formulierung muss ausrei chend Haloperoxidase enthalten, um den gewünschten Mikrobiozid-Effekt hervorzurufen. Die relativen Konzentrationen der Oxidase und ihres Substrats können angepasst werden, um ein breites Spektrum an Mikrobiozid-Aktivitäten von rascher, kurzzeitiger Mikrobiozid-Wirkung mit hoher Intensität bis hin zu langsamer, längerer Mikrobiozidsowie sporentötender Wirkung. Durch ein Erhöhen der Oxidase und indem das Oxidase-Substrat konzentrationsbegrenzend gemacht wird, wandelt die Formulierung Substrat rasch in H₂O₂ um, wodurch eine hochwirksame aber zeitlich begrenzte Mikrobiozid-Wirkung erzeugt wird. Wenn das Substrat aufgebraucht ist, kommt es zu einem Ende der oxidativen Aktivität. Andererseits wird durch ein Einschränken der Oxidase-Konzentration auch die Geschwindigkeit der H₂O₂-Generation begrenzt und es kommt zu einer langsamen aber anhaltenden Mikrobiozid-Wirkung. Die Oxidase-Konzentration beschränkt die Geschwindigkeit der H₂O₂-Produktion, und die Substrat-Konzentration beschränkt die Quantität und Dauer der H₂O₂-Produktion.
Haloperoxidasen besitzen eine sehr hohe Mikrobiozid-Kapazität und eine geringe Wirtsgiftigkeit. Diese Eigenschaften stellen zusammen mit der Fähigkeit, die zeitlich Dynamik der desinfizierenden-sterilisierenden Aktivität formulieren zu können (d. h. die Fähigkeit, die Zeitdauer oder das Zeitfenster der maximalen Mikrobiozid-Wirkung steuern zu können) eine hervorragende chemische sterilisierende Aktivität sowie minimale Wirtsgiftigkeit sicher. Wenn keine Substrate vorhanden sind, zeigen Haloperoxidasen keine direkte Toxizität bei Säugetierzellen. Die Haloperoxidase-Oxidations- und -Oxigenierungsaktivität sind funktionell mit der Verfügbarkeit von H₂O₂ verknüpft. Als solches können Materialien oder Vorrichtungen (z. B. Endoskopierohr), die mittels dieser Haloperoxidase-Formulierungen sterilisiert worden sind, unmittelbar nach der Sterilisation mit dem Wirtsgewebe in direkten Kontakt gebracht werden.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Gemäß vorliegender Erfindung werden Verfahren zum Abtöten oder Hemmen des Wachstums von Mikroorganismen bereitgestellt, die folgende Schritte umfassen:

(a) das Halten einer Mikrobiozid-Zusammensetzung, die eine Haloperoxidase, ein Halogenid und ein Peroxid erzeugendes Mittel umfasst, das fähig ist, beim Einwirken von Sauerstoff Peroxid zu erzeugen, in einer Umgebung, die weniger als etwa 1.000 ppm Sauerstoff umfasst;
(b) das Einwirkenlassen von Sauerstoff auf die Zusammensetzung, um die Mikrobiozid-Aktivität der Zusammensetzung zu aktivieren; und
(c) das Kontaktieren der Mikroorganismen mit der aktivierten Zusammensetzung, um die Mikroorganismen abzutöten oder ihr Wachstum zu hemmen.

Die Komponenten werden vorzugsweise hergestellt, vereinigt und anaerob gelagert (d. h. unter relativer Abwesenheit von Sauerstoff). Die anerobe Formulierung bleibt solange inaktiv, bis sie bei ihrer Anwendung Luft ausgesetzt wird. Das Einwirkenlassen von Luft stellt Sauerstoff, die geschwindigkeitsbegrenzende Komponente für die Mikrobiozidwirkung, zur Verfügung, um die Formulierung dazu zu aktivieren, das Wachstum von Mikroorganismen abzutöten oder zu hemmen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind hermetisch abgedichtete Behälter oder Verpackungen bereitgestellt, die die Fähigkeit einer Formulierung, die eine Haloperoxidase, ein Halogenid und ein Peroxid erzeugendes Mittel umfasst, durch das Einwirkenlassen von Luft Peroxid erzeugen zu können, aufrechterhalten. Es werden Mittel zum Abgeben der Formulierung aus dem Behälter oder der Verpackung bereitgestellt, wodurch die Formulierung durch das Einwirken von Luft aktiviert wird und das Wachstum von Mikroorganismen abtöten oder hemmen kann.
Der hierin verwendete Begriff „anaerob" oder „im Wesentlichen anaerob" bezeichnet im Wesentlichen anaerobe Bedingungen, die weniger als etwa 1000 ppm Sauerstoff, vorzugsweise weniger als etwa 500 ppm Sauerstoff, und insbesondere weniger als etwa 250 ppm Sauerstoff umfassen.
Haloperoxidasen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich eingesetzt werden, sind als Halogenid : Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktasen definiert (z. B. EC Nr. 1.11.1.7 und EC Nr. 1.11.1.10 nach der Nomenklatur der International Union of Biochemistry), bei denen Halogenid der Elektronenspender oder -reduktor und Peroxid der Elektronenempfänger oder -oxidator ist. Jede beliebige Haloperoxidase, die die Halogenid-abhängige Erzeugung von Singulett-Sauerstoffmolekülen aus Wasserstoffperoxid katalysiert, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Haloperoxidasen schließen Myeloperoxidase (MPO), Eosinophil-Peroxidase (EPO), Lactoperoxidase (LPO), Chlorperoxidase (CPO) und Derivate davon ein, wobei die derzeit bevorzugten Haloperoxidasen Myeloperoxidase und Eosinophil-Peroxidase sind. Unter „Derivaten davon" sind hierin im Allgemeinen chemisch oder funktionell modifizierte MPO, EPO, CPO und LPO zu verstehen, die sich spezifisch an Zielmikroorganismen oder spezifisch eukaryotische Zelltypen binden können und die Haloperoxidase-Aktivität zurückhalten, um die Disproportionierung von Peroxid zu verstärken, um in der Gegenwart eines geeigneten Halogenids Singulett-Sauerstoffmoleküle auszubilden, wie hierin beschrieben wird.
Für die Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung geeignete Halogenide schließen Bromid, Chlorid und/oder Iodid ein. Die Verwendung, Auswahl und Menge des in einer bestimmten Anwendung eingesetzten Halogenids hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. der in der antiseptischen Zusammensetzung verwendeten Haloperoxidase, der gewünschten antiseptischen, desinfizierenden oder sterilisierenden Wirkung und andere Faktoren. Wenn die Haloperoxidase MPO oder CPO ist, kann das Halogenid Bromid oder Chlorid sein. Die Menge an verwendetem Chlorid bewegt sich vorzugsweise im Bereich von etwa 10 μMol Chlorid bis etwa 150 μMol Chlorid pro ml an Lösung, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern. Wenn als Haloperoxidase EPO oder LPO verwendet werden, ist Chlorid als Kofaktor relativ unwirksam, und dementsprechend wird Bromid bevorzugt als Halogenid herange zogen. Sind diese in flüssigen Zusammensetzungen enthalten, so können die Zusammensetzungen der Erfindung von etwa 1 nMol Bromid bis etwa 50 μMol Bromid pro ml an flüssiger Zusammensetzung, vorzugsweise von etwa 10 nMol Bromid bis etwa 10 μMol Bromid pro ml an flüssiger Zusammensetzung, und insbesondere von etwa 100 nMol Bromid bis etwa 1 μMol Bromid pro ml flüssiger Zusammensetzung enthalten.
In Gegenwart von ausreichend Halogenid ist H₂O₂ das geschwindigkeitsbegrenzende Substrat für die Haloperoxidase-Mikrobiozid-Wirkung. Die Mikrobiozid-Aktivität ist mit der Erzeugung unterhalogeniger Säure durch Haloperoxidase:
und der darauf folgenden Erzeugung von Singulett-Sauerstoffmolekülen (¹O₂) verbunden:
Sowohl HOX als auch ¹O₂ sind wirksame antimikrobielle Reaktionspartner. Da für die HOX-Erzeugung H₂O₂ benötigt wird, und H₂O₂ mit HOX umgesetzt wird, um ¹O₂ zu erzeugen, garantiert das Haloperoxidase-System, dass sich das HOX nicht anhäufen wird sondern weiter umgesetzt wird, um ¹O₂, ein metastabiles, elektronisch angeregtes Molekül mit hoher Reaktionsbereitschaft aber begrenzter Lebensdauer, zu erzeugen.
Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Komponenten des Haloperoxidase-Systems solange unter anaeroben Bedingungen gehalten werden können, bis sie für die Verwendung bereit sind, und dann durch Einwirkenlassen von Sauerstoff aktiviert werden können. Diese Eigenschaft der Sauerstoff- oder Luftaktivierbarkeit der vorliegenden Erfindung resultiert daraus, dass in der Formulierung ein Sauerstoff-abhängiges, Peroxid erzeugendes Mittel eingeschlossen ist, das beim Einwirken von Sauerstoff aus der Luft Peroxid produziert. Geeignete Sauerstoff-abhängige, Peroxid erzeugende Mittel schließen beliebige chemische Systeme ein, die durch das Einwirken von O₂ Peroxid erzeugen können, vorausgesetzt, dass das System nicht die Haloperoxidase-Funktion hemmt, das zu desinfizierende oder zu sterilisierende Material oder die Vorrichtungen nicht beschädigt und in den verwendeten Konzentrationen auf Säugetiergewebe nicht toxisch wirkt. In einer derzeit besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peroxid erzeugende Mittel: (a) eine Oxidase (Substrat : O₂-Oxidoreduktase) und (b) ein für die Oxidase spezifisches Substrat. Oxidasen sind Substrat-spezifische Enzyme, die beim Einwirken von O₂ H₂O₂ gemäß der Reaktion (3) erzeugen:
Da die H₂O₂-Produktion sowohl vom Oxidase-spezifischen Substrat als auch von O₂ abhängig ist, sind Oxidasen in der praktischen Anwendung der Erfindung besonderes nützlich. Für diesen Zweck repräsentative Oxidasen (zusammen mit ihren zugehörigen Substraten) schließen, jedoch nicht ausschließlich, Glykolat-Oxidase, Glucose-Oxidase, Galactase-Oxidase, Hexose-Oxidase, Cholesterin-Oxidase, Aryl-Alkohol-Oxidase, L-Gulonolaceton-Oxidase, Galactose-Oxidase, Pyranose-Oxidase, L-Sorbose-Oxidase, Pyridoxin-Oxidase, Alkohol-Oxidase, L-1-Hydroxysäure-Oxidase, Ecdysom-Oxidase, Cholin-Oxidase, Aldehyd-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Pyruvat-Oxidase, Oxalat-Oxidase, Glyoxylat-Oxidase, Pyruvat-Oxidase, D-Aspartat-Oxidase, L-Aminosäure-Oxidase, Amin-Oxidase, Pyridoxaminphosphat-Oxidase, D-Glutamat-Oxidase, Ethanolamin-Oxidase, Tyramin-Oxidase, Putrascin-Oxidase, Sarcosin-Oxidase, N-Methylaminosäure-Oxidase, N-Methyllysin-Oxidase, Hydroxylnicotin-Oxidase, Glycerin-3-phosphat-Oxidase, Nitroethan-Oxidase, Acetylindoxyl-Oxidase, Urat-Oxidase, Hydroxylamin-Amin-Oxidase und Sulfit-Oxidase ein. Oxidasen, die radikalische Hydrodioxylsäure (HO₂) und ihre konjugierte Base Superoxid (O₂) erzeugen, können ebenfalls verwendet werden. Diese radikalischen Zwischenprodukte disproportionieren letztendlich, um H₂O₂ zu erzeugen. Wenn die Oxidase und ihr Substrat unter aeroben Bedingungen gehalten werden, sind sie inaktiv, da kein O₂ zur Verfügung steht, um sich an der Oxidase/Substrat-Reaktion (1) zu beteiligen. Daher wird kein H₂O₂ erzeugt, bis die Formulierung ihrer geschwindigkeitsbegrenzenden Komponente O₂ ausgesetzt wird.
Mittel, die durch das Einwirken von Sauerstoff Wasserstoffperoxid erzeugen können, wie z. B. Peroxid erzeugende Oxidasen, sind auch für die dynamische Steuerung der an der Stelle der antimikrobiellen Aktivität vorhandenen Wasserstoffperoxid-Mengen besonders nützlich. Solche Mittel maximieren die antimikrobielle Aktivität der Zusammensetzung, indem sie eine konstante, niedrige H₂O₂-Konzentration vorsehen und aufrechterhalten. Dementsprechend hängt die an solchen Mitteln verwendete Menge stark von der Eigenschaft des Mittels und der gewünschten Wirkung ab, ist jedoch vorzugsweise dazu fähig, eine konstante Menge von etwa 1 pMol bis etwa 1 μMol an Wasserstoffperoxid pro ml Flüssigkeit pro min zu erzeugen, je nach Art und Konzentration des an der Stelle antimikrobieller Aktivität vorhandenen Halogenids. Wenn die Formulierung als desinfizierende-sterilisierende Lösung verwendet wird, können die Oxidase und ihr Substrat so angepasst werden, dass sie für die Dauer des benötigten Sterilisationszeitraums eine relativ hohe, konstante Konzentrationen an H₂O₂ bereitstellen. Die desinfizierende-sterilisierende Wirkung endet, wenn das Oxidase-Substrat aufgebraucht ist, oder relativ zur Abbaugeschwindigkeit der Oxidase.
Optional kann die antimikrobielle Aktivität der Formulierungen der Erfindung gegen Hefe- und Sporenmikroorganismen verbessert werden, indem ein geeignetes die antimikrobielle Aktivität verstärkendes Mittel, wie es in der US-A-5.389.369 offenbart wird, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist, in die Formulierung aufgenommen wird. Im Allgemeinen sind geeignete die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel Komponenten, die die antimikrobielle Aktivität des antimikrobiellen Haloperoxidase-Systems gegen Hefe- und Sporenmikroorganismen verstärken, indem sie die Hefe- und Sporenformen der Mikroorganismen durch die Haloperoxidase-Mikrobiozid-Aktivität labilisieren, und die keine nachteiligen Auswirkungen auf die Haloperoxidase-Aktivität des Systems oder unerwünschte Auswirkungen auf den Anwendungsbereich haben. Derzeit bevorzugte die Aktivität verstärkende Mittel der Erfindung umfassen α-Aminosäure-Zusammensetzungen der Formel:
worin R₁ Wasserstoff, eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine unsubstituierte oder Hydroxy- oder Amino-substituierte, unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen ist und R₂ Wasserstoff oder eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist. Die hierin verwendeten Aminosäuren können in Form ihrer Säure, wie oben dargestellt, oder in ihrer Zwitterionenform vorliegen, die durch die Formel:
dargestellt ist, worin R₁ und R₂ die oben erläuterten Bedeutungen haben, und können entweder in ihrer l- oder d-Enantiomer-Konfiguration vorliegen. Repräsentative R₁-Alkylgruppen sind beispielsweise Methyl-, Hydroxymethyl-, Isopropyl-, 2-Isobutyl-, 1-Isobutyl-, Hydroxyethyl- und Aminobutyl-Gruppen. Repräsentative R₁-Arylalkylgruppen sind beispielsweise Tolyl- und Hydroxytolyl-Gruppen. Repräsentative, die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel der Erfindung umfassen α-Aminosäuren, die aus der aus Glycin und den l- oder d-Enantiomeren von Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Lysin, Phenylalanin, Tyrosin und den Alkylestern davon bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Die derzeit besonders bevorzugten, die antimikrobielle Aktivität verstärkenden Mittel sind Glycin und l-Alanin.
Gemäß anderen Aspekten der Erfindung können anaerobe Formulierungen, die Oxidase, Oxidase-spezifisches Substrat, Halogenid und Haloperoxidase enthalten, formuliert werden und bei Umgebungstemperatur für eine langfristige Lagerung verpackt werden. Derartige Formulierungen rufen bei Lufteinwirkung eine starke Mikrobiozid-Wirkung hervor. Darüber hinaus können O₂-aktivierbare, desinfizierende-sterilisierende Zusammensetzungen formuliert werden, um unterschiedlich starke Wirkungen und unterschiedliche Aktivitätszeiträume zu erreichen. Wie aus der obigen Gleichung (1) abgeleitet werden kann, ist die Geschwindigkeit der H₂O₂-Generation von der Oxidase-Kon zentration abhängig, während die Menge an erzeugtem H₂O₂ proportional zur vorhandenen Substratmenge ist. Wenn das Substrat nicht begrenzend wirkt, ist die Geschwindigkeit der H₂O₂-Erzeugung direkt proportional zur Oxidase-Aktivität. Wenn die Oxidase-Aktivität nicht begrenzend wirkt, ist die Menge und Dauer der H₂O₂-Erzeugung abhängig von der Verfügbarkeit des Oxidase-spezifischen Substrats. Wird eine hochwirksame, kurzzeitige desinfizierende-sterilisierende Wirkung gewünscht, sollte die Formulierung eine geeignete Haloperoxidase und ein geeignetes Halogenid sowie relativ hohe Oxidase-Aktivität aufweisen, wobei ausreichend Substrat vorhanden sein muss, um die Aktivität auf den gewünschten Zeitrahmen zu begrenzen. Eine weniger starke, jedoch lang andauernde sterilisierende Wirkung kann mit einer geeigneten Haloperoxidase und einem geeigneten Halogenid, relativ geringer Oxidase-Aktivität und einer ausreichenden Menge an Substrat formuliert werden, um die Reaktion für den gewünschten Zeitraum aufrechtzuerhalten. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, sind Systeme dieser Art formuliert worden, um eine Mikrobiozid-Sporizid-Wirkung zu erzielen, die für einen Zeitraum von zwei Tagen nach Lufteinwirkung anhält.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung als antiseptische Mittel eingesetzt, die eine verstärkte Haloperoxidase-Aktivität gegen Sporen und Hefe aufweisen und gegen eine Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen einschließlich Bakterien und Pilzen wirken. Um für den Kontakt mit Wirtsgewebe verwendet werden zu können, basieren die antiseptischen Systemen auf der Verwendung von dioxygenierenden Haloperoxidase-Enzymen, die eine selektive Affinität für pathogene Mikroorganismen aufweisen. Als solche kann die hochwirksame Mikrobiozid-Wirkung auf die Zielmikroorganismen ausgerichtet werden, ohne dass damit verbundenes Wirtsgewebe oder die normale Flora zerstört wird; d. h. die antiseptische Wirkung ist selektiv und auf die Zielmikroorganismen begrenzt.
Die Hyloperoxidase-Verstärkungszubereitungen können, wenn richtig formuliert, dazu verwendet werden, Materialien und Vorrichtungen zu desinfizieren und sogar zu sterilisieren. Hochwirksame Haloperoxidase-Verstärkungsformulierungen können als in vitro Desinfektions- oder Sterilisationszubereitungen dienen. Durch die Begrenzung des Zeitraums, in dem Wasserstoffperoxid zur Verfügung steht, können Haloperoxidase-Verstärkungsformulierungen wirksam genug gemacht werden, um eine Desinfizierung und sogar eine Sterilisation eines Materials oder einer Vorrichtung sicherzustellen, bevor dieses mit dem Wirtsgewebe in Kontakt kommt. Jede mögliche toxische Wirkung auf die normale Flora und das Wirtsgewebe, die mit der Verwendung solch hochwirksamer Formulierungen verbunden ist, lässt nach, wenn das Peroxid aufgebraucht ist, und das mit der Formulierung behandelte Material oder Vorrichtung kann ohne zusätzliches Abwaschen zur Entgiftung mit dem Wirtsgewebe in Konakt gebracht werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Zusammensetzungen der Erfindung speziell für In-Vitro-Anwendungen, wie z. B. zum Desinfizieren oder Sterilisieren von medizinischen Geräten, Kontaktlinsen und dergleichen, insbesondere für Anwendungen, bei denen die Vorrichtungen oder Linsen im Kontakt mit einem Patienten oder Träger verwendet werden sollen, ausgebildet. Für derartige Anwendungen können die Zusammensetzungen bequem in Form einer Flüssigkeit oder eines Schaums bereitgestellt werden und können mit Emulgatoren, Tensiden, Puffern, Netzmitteln, Konservierungsmitteln und anderen häufig in solchen Zusammensetzungen vorzufindenden Komponenten versetzt sein. Die Zusammensetzungen der Erfindung können in absorbierende Materialien, wie z. B. Nähte, Verbände und Gaze, imprägniert werden oder auf die Oberfläche von Festphasenmaterialien, wie z. B. Klammern, Reißverschlüsse und Katheter aufgezogen werden, die verpackt und unter im Wesentlichen anaeroben Bedingungen aufbewahrt werden, wie z. B. in versiegelten Folien und/oder luftundurchlässigen Polymerbeuteln oder -taschen. Die Taschen oder Beutel können dann geöffnet werden, um die Zusammensetzungen an eine Stelle zuzuführen, um dort mikrobieller Infektion vorzubeugen. Andere Zufuhrsysteme dieser Art sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich.
Die tatsächlichen Mengen an Haloperoxidase, Halogenid, Peroxid erzeugendem Mittel und/oder die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden, so dass an der zu behandelnden Stelle Mengen an Haloperoxidase und die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel vorhanden sind, die vegetative Mikroorganismen sowie Hefe- und Sporenmikroorganismen wirksam abtöten können. Dementsprechend sind die gewählten Mengen von der Art sowie dem Ort der Behandlungsstelle, der erwünschten Reaktion, der gewünschten Dauer der Mikrobiozid-Wirkung und anderen Faktoren abhängig. Wenn als Haloperoxidase Myeloperoxidase, Esinophil-Peroxidase, Lactoperoxidase oder Zusammensetzungen davon verwendet werden, umfassen die flüssigen Zusammensetzungen der Erfindung im Allgemeinen zumindest 0,01 Picomol (pMol) Haloperoxidase pro ml flüssiger Zusammensetzung, vorzugsweise von etwa 0,1 pMol bis etwa 500 pMol Haloperoxidase pro ml flüssiger Zusammensetzung, und insbesondere etwa 0,5 pMol bis etwa 50 pMol Myeloperoxidase pro ml flüssiger Zusammensetzung. Optional kann es bei manchen Anwendungen erwünscht sein, sowohl Eosinophil-Peroxidase und Myeloperoxidase in derselben Zusammensetzung einzuschließen. Flüssige Zusammensetzungen der Erfindung umfassen im Allgemeinen zudem 100 pMol/ml bis 300 pMol/ml Chlorid, 10 pMol/ml bis 50 pMol/ml Bromid, 1 pMol/ml bis 5 pMol/ml Iodid oder Kombinationen davon. Optional können flüssige Zusammensetzungen der Erfindung im Allgemeinen zumindest 0,005 pMol/ml an die an antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel, d. h. α-Aminosäuren wie z. B. Glycin und Alanin, und vorzugsweise 0,05 pMol/ml bis 50 pMol/ml solcher die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel umfassen. Zuletzt können flüssige Zusammensetzungen der Erfindung im Allgemeinen 0,05 bis 10 Einheiten/ml an Enzym, wie z. B. Glucoseoxidase, das dazu fähig ist, ein Substrat zu oxidieren, wie z. B. Glucose, und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zu reduzieren. Zusätzlich können auch von 0,1 bis 10 pMol/ml an Substrat für das Enzym enthalten sein. Die vorher genannten Komponenten werden üblicherweise in einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Träger vereinigt.
Zur Veranschaulichung kann eine Zusammensetzung, die als Kontaktlinsenlösung verwendet werden kann, beispielsweise 1 bis 20 pMol/ml Eosinophil-Peroxidase und/oder Myeloperoxidase, 0,1 bis 10 pMol/ml Glycin, 0,01 bis 10 Einheiten Glucoseoxidase und 50 bis 300 mÄqu./l Chlorid mit 0,1 bis 5 mÄqu./l Bromid umfassen. Die obige Zusammensetzung wird unter anaeroben Bedingungen mit 0,1 bis 10 μMol/ml Glucose vereinigt, und die gesamte Zubereitung wird bis zur Verwendung als flüssige Desinfektions- oder Sterilisationslösung anaerob gehalten. Das Einwirkenlassen von Luft, d. h. molekularem Sauerstoff, aktiviert die desinfizierende-sterilisierende Wirkung der Formulierung.
Aufgrund der selektiven Bindungskapazitäten von Myeloperoxidase und Eosinophil-Peroxidase wirken selbst hochwirksame Formulierungen nur geringfügig toxisch auf Säugetiergewebe. Darüber hinaus verringert die Fähigkeit, den Zeitraum maximaler Wirksamkeit zeitlich begrenzen zu können, das Wirtstoxizitätspotential weiters, indem die Zeitdauer hochwirksamer Desinfektion-Sterilisation auf die Zeit vor dem Kontakt mit dem Wirt beschränkt wird. Ein Material oder eine Vorrichtung, die mit dem Desinfektions-Sterilisationsmittel behandelt worden ist, kann daher nach dem Sterilisationszeitraum in direkten Kontakt mit dem Wirtsgewebe gebracht werden.
Dieser sowie andere Aspekte der Erfindung werden in Verbindung mit den folgenden Beispielen, die zu Veranschaulichungszwecken, jedoch nicht als Einschränkung angeführt werden, besser verständlich.
Beispiel 1
Anaerobe Formulierung mit Mikrobiozid-Aktivität bei Lufteinwirkung
Als anaerobe Kammer wurde eine gasundurchlässige Glove Box vorbereitet, indem diese zuerst mit Stickstoff begast wurde (N₂, 99,99% sauerstofffrei). Nachdem der Prozentanteil an O₂ auf 0,1% gefallen war, wurden 5 anaerobe Gas-Packungen geöffnet und in der Kammer aktiviert. Folgende Lösungen und Bakteriensuspension wurden zubereitet und in die anaerobe Kammer gegeben:

(a₁) Glucose-Oxidase (GOX), präpariert aus Typ-VII-Aspergillus-niger-GOX (Sigma Chemicals).
(a₂) Acetatpuffer ohne GOX.
(b) Myeloperoxidase-Lösung (MPO, Chargennr. 1899201, ExOxEmis Inc.), die D-Glucose, Chlorid und eine sehr geringe Menge an Bromid enthielt.
(c) Suspension von Staphylococcus aureus.

Als sich die Sauerstoffkonzentration zwischen 0,01 und 0,02%, d. h. 100 bis 200 ppm, stabilisiert hatte, wurde die Lösung (a₁) oder die Lösung (a₂) mit (b) vermischt, und ein Teil jedes Gemischs sowie ein Teil der Bakteriensuspension (c) wurde aus der Kammer entfernt. Nach etwa 10 min wurde die Bakteriensuspension den aeroben bzw. anaeroben Gemischen mit GOX (a₁) und ohne GOX (a₂) beigemengt. Die endgültigen Lösungen enthielten entweder 0,6 Einheiten GOX oder kein GOX, 56 μMol D-Glucose, 5 pMol MPO und etwa 3 × 10⁷ Staphylococcus aureus-Bakterien pro ml von 50 mM Acetatpuffer mit 100 mÄqu./l Cl^– und 1 mÄqu./l B^–, pH 6, bei Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Luft (Umgebungssauerstoff). Aus den Testlösungen wurden nach 1,25, 2,5, 5, 10 und 20 min Proben (100 μl gemischte Suspension) gezogen, die umgehend mit 0,9 ml an 0,1%igem Thioglykolat mit 200 Einheiten Katalase (Sigma Chemicals) verdünnt wurden, um das oxidative Abtöten zu beenden. Die Proben wurden weiter verdünnt und auf Trypticase-Soja-Agar aufgebracht (Hockeystock-Verfahren). Die Bakterienkolonien wurden nach einer Inkubationszeit von 1 bis 2 Tagen bei 37°C gezählt, und die Staphylococcus aureus-Überlebensrate ist, wie in Tabelle 1 angeführt, als koloniebildende Einheiten (CFU, "colony forming units") pro ml ursprünglicher Suspension angegeben. In Tabelle 1 und den nachfolgenden Beispielen steht 0 für kein Wachstum bei der geringsten getesteten Verdünnung, d. h. weniger als 100 CFU.
Tabelle 1 Sauerstoff-abhängiges Abtöten von Staphylococcus aureus
Vollständige Abtötung des Staphylococcus aureus wurde beim kompletten GOX-MPO-System in Gegenwart von O₂ beobachtet. Obwohl beim Nicht-Vorhandensein von 0₂ in den ersten 5 min im GOX-MPO-Vollsystem keine Abtötung beobachtet werden konnte, kam es nach einer Einwirkung von 10 und 20 min zu einer unvollständigen Abtötung. Diese unvollständige Abtötung lässt sich durch die Tatsache erklären, dass die anaerobe Kammer immer noch 0,01 bis 0,02% O₂ enthielt. Obwohl die Sauerstoffkonzentration in der aneroben Kammer nur etwa einem Tausendstel jener der Luft entspricht, reicht diese Menge an O₂ aus, um eine partielle Mikrobiozid-Wirkung auszulösen. Beim MPO-Alleinsystem (ohne GOX) konnte weder beim Vorhandensein noch beim Nicht-Vorhandensein von O₂ eine Abtötung beobachtet werden.
Beispiel 2
Anaerobe Zubereitung und O₂-Aktivierung der Mikrobiozid-Sporizid-Aktivität hochwirksamer MPO- und EPO-basierter Formulierungen
Die anaerobe Kammer wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch die die GOX-XPO-Formulierung umfassenden Komponenten verändert wurden und Glycin zugegeben wurde, um eine Sporizid-Wirkung wie in der US-A-5.389.369 (Allen) zu ermöglichen. Zwei unterschiedliche Formulierungen wurden anaerob zubereitet. Die erste Formulierung enthielt 0,5 Einheiten GOX (Typ-VII-Aspergillus-niger-GOX, Sigma Chemicals) plus 56 μMol D-Glucose, 30 pMol MPO (vom Schwein, Chargennr. 1899201, ExOx-Emis, Inc.) und 2 μMol Glycin pro ml von 50 mM Acetatpuffer mit 100 mÄqu./l Cl^– und 1 mÄqu./l Br^–, pH 6. Die zweite Formulierung war gleich, abgesehen davon, dass MPO durch 30 pMol EPO (Chargennr. 1929201, ExOxEmis Inc.) ersetzt wurde. Beide Formulierungen wurden anschließend vor dem Testen für mehr als eine Woche anaerob altern gelassen.
Die Mikrobiozid-Kapazität der GOX-MPO-Glycin-Formulierung wurde nach 12 Tagen anaerober Lagerung untersucht. Wie in Tabelle 2 angeführt wurde die Formulierung auf einen breiten Bereich an gramnegativen und grampositiven Bakterien, Hefe- und Pilzsporen hin getestet. Bei jeder Prüfbedingung wurden 400 μl der GOX-MPO-Glycin-Formulierung und 200 μl Mikroben-Suspension herangezogen, die durch Einwirkenlassen von Luft (Umgebungssauerstoff) aktiviert wurden. Die Proben wurden nach 0, 5, 10 und 20 min Inkubation (für die Bakterien) und nach 20, 30 , 60 und 90 min Inkubation (für die Hefe- und Pilzsporen) entnommen, umgehend mit 0,9 ml 0,1%igem Thioglykolat mit 200 Einheiten Katalase verdünnt und auf Tripticase-Soja-Agar (Bakterien) bzw. Sabouraud-Dextrose-Agar (Hefe und Pilze) aufgebracht. Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 4 Tagen bei 37 °C wurden die Kolonien gezählt.
Die MPO-Konzentration (18 pMol/ml, zuletzt) der Formulierung tötete alle getesteten gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich Streptokokken der Gruppe A, wirksam ab. Die Abtötung war nach einer Einwirkung von 5 bis 20 min vollendet. die Formulierung tötete zudem die getesteten Hefe- und Pilzsporen wirksam ab, wobei jedoch für vollständige Abtötung ein längeres Einwirkenlassen, d. h. 30 bis 90 min, nötig war.
Tabelle 2 Anaerobe versus Aerobe Mikrobiozid-Wirkung der GOX-MPO-Glycin-Formulierung 0,3 Einheiten GOX, 18 pMol MPO & 1 μMol Glycin (Reaktionsendkonz. pro ml)
Die Mikrobiozid-Kapazität der GOX-EPO-Glycin-Formulierung wurde nach 13 Tagen anaeober Lagerung untersucht. Die EPO-basierte Formulierung wurde unter denselben Testbedingungen auf dieselben Mikroben getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.
Die EPO-basierte Formulierung war gleich wirksam wie die vorher untersuchte MPO-basierte Formulierung und wirkte schneller. Bei der gegebenen EPO-Konzentration (18 pMol/ml, zuletzt) waren sämtlich gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich Gruppe-A-Streptokokken nach einer Einwirkzeit von 5 min vollständig abgetötet. Die Abtötung von Candida albicans und Fusarium moniliforme war ebenso nach 90 min abgeschlossen.
Tabelle 3 Anaerobe versus Aerobe Mikrobiozid-Wirkung der GOX-EPO-Glycin-Formulierung 0,3 Einheiten GOX, 18 pMol EPO & 1 pMol Glycin (Reaktionsendkonz. pro ml)
Beispiel 3
Zubereitung und Testen von O₂-aktivierten Mikrobiozid-Sporizid-Formulierungen in Drucksprühdosen
Zubereitung des Sprühsterilisatormittels:
Zubereitung von Stammlösungen: Eine 10%ige (Vol./Vol.) Tween 80 Lösung wurde durch Zugabe von 10 ml Tween 80 zu 90 ml H₂O hergestellt. Eine 1%ige (Gew./Vol.) EDTA-Lösung wurde durch Zugabe von 1 g Na₂EDTA zu 100 ml H₂O hergestellt. Eine 0,1 M Glycin-Lösung wurde durch Zugabe von 1,5 g Glycin (MG = 75) zu 200 ml H₂O hergestellt. Eine 0,5%ige (Gew./Vol.) Hydroxypropyl-Methyl-Cellulose-Lösung (HPMC, 100 Centipoise) wurde durch Zugabe von 1 g HPMC zu 200 ml H₂O und vorsichtigem Mischen, bis es vollständig gelöst war, hergestellt. Eine 250 Einheit/ml GOX (Typ VII von Aspergillus niger, Sigma Chemicals) wurde in H₂O hergestellt. Eine 0,1 M Glucose-Lösung wurde durch Zugabe von 1,8 g D-Glucose (MG = 180) zu 100 ml H₂O hergestellt.
Zubereitung einer einfachen Sterilisatorarbeitslösung:
Die obigen Inhaltsstoffe wurden zu 300 ml H₂O in der angegebenen Reihenfolge zugegeben. Jede Materialzugabe wurde vor der nächsten Zugabe vollständig gelöst. Die Arbeitslösung und D-Glucose-Lösungen wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert und beide Lösungen wurden in die anaerobe Kammer gegeben. Als sich die Kammer bei etwa 20 bis 100 ppm O₂ stabilisiert hatte, wurden 40 m) 0,1 M D-Glucose zur Arbeitslösung zugegeben, um eine Endkonzentration von 7 mM (130 mg/dl) zu erreichen.
Ungefähr 100 ml der vollständigen einfachen Sterilisatorlösung wurden mittels einer mit Zwischenstück angepassten Spritze durch ein Klappenventil in 45 x 165 mm EP-Sprühsystemkanister (Gesamtkapazität: 140 ml) eingefüllt. Die Dosen wurden dann aus der Kammer entfernt, und die äußere Kammer des Kanisters wurde mit Stickstoff (N₂) unter Druck gesetzt.
Zubereitung einer komplexen Sterilisatorlösung:
Die obigen Inhaltsstoffe wurden zu 300 ml H₂O in der angegebenen Reihenfolge zugegeben. Jede Lösungszugabe wurde vor der nächsten Zugabe vollständig gelöst. Die Arbeitslösung und D-Glucose-Lösungen wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert, und beide Lösungen wurden in die anaerobe Kammer gegeben. Als sich die Kammer bei etwa 20 bis 30 ppm O₂ stabilisiert hatte, wurden 40 ml 0,1 M D-Glucose zur Arbeitslösung zugegeben, um eine Endkonzentration von 7 mM (130 mg/dl) zu erreichen.
Etwa 100 ml der vollständigen komplexen Sterilisatorlösung wurden in jeden EP-Sprühsystemkanister gefüllt, und die Kanister mit N₂ wie oben beschrieben unter Druck gesetzt.
Um die Mikrobiozid-Kapazitäten der einfachen Sterilisatorlösung und der komplexen Sterilisatorlösung gegen Escherichia coli und Aspergillus fumigatus (Sporen) zu testen, wurden 0,4-ml-Aliquoten frisch versprühter einfacher Sterilisatorlösung (4 Kanister wurden getestet) und komplexer Sterilisatorlösung (3 Kanister wurden getestet) zu 0,1 ml der Mikroben-Suspensionen in Gegenwart von Luft zugegeben. A. fumigatus-Platten wurden nach einer Inkubationszeit von 120 h abgelesen. Die Kanister-Zubereitungen waren zum Zeitpunkt des Tests 16 Tage alt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt. Beide sterilisierenden Lösungen führten zu einer wirksamen bakteriziden Wirkung. Pilz-Sporizidwirkung war gegeben, jedoch nach 90 min Einwirkung nicht abgeschlossen.
Tabelle 4 Mikrobiozid-Aktivität der einfachen und komplexen Sterilisatorlösungen unter Lufteinwirkung
Die Lagerbeständigkeit der Kanister mit Sterilisatorlösung wurde getestet, indem die Zubereitungen bei 4 °C, bei Raumtemperatur und bei 40 °C für etwa 1 Monat gealtert wurden und anschließend das oben in Zusammenhang mit Tabelle 4 beschriebene Verfahren wiederholt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angeführt.
Tabelle 5 Auswirkung von Temperatur auf die Mikrobiozid-Kapazität der Kanister mit einfacher und komplexer Sterilisatorlösung
Wie in Tabelle 5 gezeigt wird, erhielten sowohl die einfache Sterilisatorlösung als auch die komplexe Sterilisatorlösung nach ein monatiger Lagerung die volle Wirksamkeit gegen E. coli aufrecht. Auch eine Fungizid-Aktivität gegen A. fumigatus konnte nach einmonatiger Lagerung noch beobachtet werden.
Beispiel 4 Zubereitung, Qualitätskontrolle auf Lumineszenz-Basis und Mikrobiozid-Kapazität einer hochwirksamen, O₂-aktivierten Mikrobiozid-Sporizid-Formulierung Zubereitung einer hochwirksamen Arbeitslösung:
Die oben beschriebenen Inhaltsstoffe wurden wie in Beispiel 3 gemischt. Die Arbeitslösung und eine 0,56 M D-Glucose-Lösung wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert, und beide Lösungen wurden in die anaerobe Kammer gegeben. Die große Größenordnung dieser Herstellung machte ein Senken und Halten der O₂-Konzentration schwierig. Die minimale erreichte O₂-Konzentration betrug 35 ppm. 125 ml 0,56 M D-Glucose wurden zur Arbeitslösung zugegeben, um eine Glucose-Endkonzentration von 6,9 nM (130 mg/dl) zu erreichen. Etwa 100 ml der vollständigen hochwirksamen Sterilisatorlösung wurden in jeden EP-Sprühsystemkanister eingefüllt, und die Kanister wurden wie in Beispiel 3 beschrieben mit N₂ unter Druck gesetzt. 99 Kanister wurden gefüllt.
Die Mikrobiozid-Kapazitäten von Kanistern, die am Anfang, in der Mitte und am Ende hergestellt worden waren, wurde mittels dem vorher in Zusammenhang mit den Daten aus Tabelle 4 beschriebenen Verfahren getestet. Escherichia coli (119.800.000 CFU/ Test) wurden bei sämtlichen getesteten Sterilisatorkanistern innerhalb von 30 min abgetötet. Obwohl das Abtöten von Aspergillus fumigatus-Sporen (2.300.000 CFU/Test) nicht abgeschlossen war, erreichten die Sterilisatorkanister nach einer Einwirkzeit von 90 min bei Raumtemperatur eine hundertfache Abtötungsrate.
Beispiel 5
Zubereitung und Testen von O₂-aktivierter, desinfizierenden-sterilisierender Lösungen mit unterschiedlichen Substrat-Oxidase-Antriebsmitteln Zubereitung einer desinfizierenden-sterilisierenden Linsenlösung: Zubereitung von Stammlösungen: Tween 80 und Na₂EDTA-Lösungen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Eine 1,0 M Glycinlösung wurde durch Zugabe von 75 g (M. W. 75) zu 1 l H₂O zubereitet. Eine 1%ige (Gew./Vol.) Hydroxypropylmethylcellulose-Lösung (HPMC, 100 Centipoise) wurde durch Zugabe von 5 g HPMC zu 500 ml H₂O und vorsichtiges Mischen, bis diese vollständig gelöst war, hergestellt. Acetatpuffer (20 mM, pH 6,8) wurde durch Zugabe von 1,2 ml Eisessig (C₂H₄O₂, MG = 60) und 1,64 g Natriumacetat (NaC₂H₃O₂, MG = 82) pro Liter H₂O hergestellt.
Zubereitung einer normalen Arbeitslösung:
Die Inhaltsstoffe wurden wie oben beschrieben gemischt. Die Arbeitslösung wurde für die Herstellung von vier unterschiedlichen Substrat-Oxidase-Zubereitungen verwendet. Die vier getesteten Oxidasen waren: (1) Cholinoxidase, (2) Glycerin-3-phosphat-Oxidase, (3) Galactose-Oxidase und (4) D-Aminosäure-Oxidase. Die Oxidase-Endaktivität aller Zubereitungen lag bei 1 Einheit/ml der Endzubereitung. Cholin, Glycerin-3-phosphat, D-Galactose und Glycin wurden mit einer Endkonzentration von 2,5 mM als Substrate für die Oxidasen eingeschlossen. Die MPO-Konzentration der Zubereitung lag bei etwa 100 pMol/ml. Die Lösungen wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert und in die anaerobe Kammer gegeben. Die erreichte minimale O₂-Konzentration betrug 10 ppm. Nach dem Aufbrauchen des O₂ wurden die Oxidasen und ihre spezifischen Substrate zu den verschiedenen Zubereitungen in der anaeroben Kammer zugegeben. Etwa 100 ml jeder vollständigen Substrat-Oxidase-Sterilisatorlösung wurde in jeden der EP-Sprühsystemkanister eingefüllt, und die Kanister wurden wie in Beispiel 3 beschrieben mit N₂ unter Druck gesetzt.
Diese Versuche waren darauf ausgerichtet, die Möglichkeiten zu testen, andere Substrat-Oxidase-Kombinationen als Glucose/Glucose-Oxidase für die Formulierung von O₂-aktivierten desinfizierenden-sterilisierenden Lösungen zu verwenden. Anhand des Verfahrens aus Beispiel 3 wurde die antikmikrobielle Aktivität jeder Zubereitung gegen E. coli und S. aureus getestet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 6 angeführt, wobei „Verdünnung" die Verdünnung des Sterilisators angibt; d. h. das Endverhältnis von MPO : Oxidase zu Mikroben-Suspension, und 0 steht für kein Wachstum bei der geringsten Verdünnung, d. h. weniger als 100 CFU.
Tabelle 6 Mikrobiozid-Kapazitäten verschiedener Substrat-Oxidase-Formulierungen
Jede der Substrat-Oxidase-Formulierungen aus Tabelle 6 wies eine Mikrobiozid-Wirkung auf, doch keine der getesteten Zubereitungen zeigte einen besonderen Vorteil gegenüber dem vorher getesteten Glucose/Glucose-Oxidase-System.
Beispiel 7
Zubereitung und Testen von O₂-aktivierten desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen für die ophtalmische Verwendung
Zubereitung einer desinfizierenden-sterilisierenden Linsenlösung:
Zubereitung von Stammlösungen: Die Stammlösungen entsprachen im Wesentlichen den in Beispiel 6 beschriebenen.
Zubereitung einer desinfizierenden-sterilisierenden Linsenarbeitslösung:
Die Inhaltsstoffe wurden wie vorhergehend beschrieben gemischt, um die Arbeitslösung herzustellen. Die Glucose-Oxidase vom Typ VII (1.000 Einheiten GOX/ml) wurde zur
Lösung hinzugefügt, um vier Formulierungen herzustellen:
Formulierung A: 0,5 ml GOX/l Lösung ∴ 0,5 Einheiten/ml (zuletzt).
Formulierung B: 1 ml GOX/l Lösung ∴ 1 Einheit/ml (zuletzt).
Formulierung C: 2 ml GOX/l Lösung ∴ 2 Einheiten/ml (zuletzt).
Formulierung D: 4 ml GOX/l Lösung ∴ 4 Einheiten/ml (zuletzt).
Die MPO-Konzentration der Zubereitung (unverdünnt) betrug etwa 100 pMol/ml. die Lösungen wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert und in die anaerobe Kammer gegeben. Die erreichte minimale O₂-Konzentration war 10 ppm. Nach dem Aufbrauchen des O₂ wurden die Oxidasen und ihre spezifischen Substrate zu den verschiedenen Zubereitungen in der anaeroben Kammer hinzugefügt. Etwa 100 ml jeder vollständigen desinfizierenden-sterilisierenden Linsenformulierung wurden in jeden der EP-Sprühsystemkanister eingefüllt, und die Kanister wurden wie vorhergehend beschrieben mit N₂ unter Druck gesetzt.
Diese vier Zubereitungen waren darauf ausgerichtet und getestet, eine desinfizierendesterilisierende Kontaktlinsenpflegeformulierung mit hervorragender Mikrobiozid-Sporizid-Kapazität und minimalen Wirtstoxizitätspotential zu erzeugen. Die Versuche mit diesen Formulierungen waren zudem so gestaltet, dass Fragen bezüglich der Aktivitätsdauer nach dem Einwirken von O₂ und der langfristigen Lagerbeständigkeit der Kanisterzubereitungen geklärt werden konnten. Die Mikrobiozid-Sporizid-Aktivitäten der Formulierungen gegen 5. aureus, E. coli und A. fumigatus wurden mittels dem Verfahren aus Beispiel 3 unmittelbar 2 h und 4 h nach der Lufteinwirkung getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angeführt. Die Formulierungen sind in die Kanister gefüllt worden und zum Zeitpunkt der Tests sechs Monate gelagert gewesen.
Tabelle 7 Mikrobiozid-Aktivität in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung bei ophtalmischen desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen (6 Monate nach der Herstellung)
Vollständige Abtötung der Staphylococcus aureus und Escherichia coli konnte bei allen Formulierungen zu jeden getesteten Zeitpunkt nach der O₂-Einwirkung beobachtet werden. Die Abtötung der Apergillus fumigatus-Sporen unmittelbar nach dem Einwirken von Luft auf die Formulierungen war proportional zur GOX-Konzentration der Formulierungen. Die Formulierung A (0,5 Einheiten GOX/ml) wies nur eine minimale Abtötungsrate auf. Die Formulierungen B, C und D, deren GOX-Aktivität progressiv anstieg, zeig ten auch progressiv höhere Abtötungsraten. Die Formulierungen wiesen 2 h und 4 h nach dem Einwirken von O₂ sogar eine noch besseres Mikrobiozid-Sporizid-Aktivität auf. Die Formulierungen waren 4 h nach dem Einwirken von O₂ am wirksamsten. Um diesen Trend weiter untersuchen zu können, wurde der Versuch erweitert und Zeitpunkte eingeschlossen, deren zeitlicher Abstand zum Einwirken von 0 noch größer war, wobei die Formulierungen verwendet wurden, die für 7 Monate in den Kanistern gelagert worden waren. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle 8 angeführt.
Tabelle 8 Mikrobiozid-Aktivität in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung bei den ophtalmischen desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen (7 Monate nach der Herstellung)
Die Ergebnisse der Tests, die 4 h nach der O₂-Einwirkung durchgeführt wurden, stimmten zwischen Anfangsversuch (Tabelle 7) und Folgeversuch (Tabelle 8) im Wesentlichen überein. Die Mikrobiozid-Sporizid-Aktivitäten der Formulierungen 8 h nach dem Einwirken von O₂ blieben gleich oder nahmen leicht zu. 12 h und insbesondere 24 h nach der O₂-Einwirkung konnte jedoch eine geringfügige Abnahme bei der Abtötungsrate von Staphylococcus aureus und Aspergillus fumigatus beobachtet werden.
Wie in der US-A-5.389.369 offenbart ist, müssen zum Abtöten von Pilzsporen MPO: GOX desinfizierende-sterilisierende Lösungen relativ lange einwirken. Daher wurden die Versuche aus Tabelle 8 mit Einwirkzeiten von 12 h und 24 h wiederholt, um einen Vergleich zwischen der Bakterizid-Fungizid-Wirkung nach 1 h und der nach 4 h Einwirkung der desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen zu ermöglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angeführt.
Tabelle 9 Mikrobiozid-Wirkung in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung und des Mikroben-Kontakts bei ophtalmischen desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen (8 Monate nach der Herstellung)
Die Mikrobiozid-Kapazitäten der Formulierungen, die für 11 Monate in den Kanistern gelagert worden waren, wurden gegen Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans nach O₂-Einwirkzeiten von bis zu 48 h getestet. Die Abtötungskapazität wurde für Einwirkzeiten von 1 h sowie 4 h gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angeführt.
Tabelle 10 Mikrobiozid-Aktivität in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung und des Mikroben-Kontakts bei desinfizierenden-sferlisierenden Linsenformulierungen (10 Monate nach der Herstellung)
Elf Monate nach der Herstellung töteten alle Formulierungen Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans nach einer O₂-Einwirkzeit von 24 h oder länger vollständig ab.
Zuletzt wurde die Mikrobiozid-Aktivität für verschiedene Verdünnungen der Formulierung D (oben beschrieben), die ein Jahr lang in den Kanistern gelagert worden war, gegen E. coli, P. aeruginosa, C. albicans und A. fumigatus in Bezug auf Lufteinwirkzeiten von bis zu 24 h bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angeführt.
Wie aus Tabelle 11 ersichtlich ist, war die Formulierung D nach einem vollen Jahr Lagerung immer noch gegen alle getesteten Organismen hochaktiv.

Claims

Verfahren zum Abtöten oder Hemmen des Wachstums von Mikroorganismen, folgende Schritte umfassend: (a) das Halten einer Mikrobiozid-Zusammensetzung, die eine Haloperoxidase, ein Halogenid und ein Peroxid erzeugendes Mittel umfasst, das fähig ist, beim Einwirken von Sauerstoff Peroxid zu erzeugen, in einer Umgebung, die weniger als etwa 1.000 ppm Sauerstoff umfasst; (b) das Einwirkenlassen von Sauerstoff auf die Zusammensetzung, um die Mikrobiozid-Aktivität der Zusammensetzung zu aktivieren; und (c) das Kontaktieren der Mikroorganismen mit der aktivierten Zusammensetzung, um die Mikroorganismen abzutöten oder ihr Wachstum zu hemmen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Haloperoxidase aus der aus Myleoperoxidase, Eosinophil-Peroxidase und Lactoperoxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Halogenid aus der aus Chlorid, Bromid, Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peroxid erzeugende Mittel ein Enzym ist, das zum Oxidieren eines Substrats und Reduzieren von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid fähig ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Enzym Glucose-Oxidase ist und das Substrat Glucose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Haloperoxidase Myeloperoxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Haloperoxidase Eosinophil-Peroxidase ist und das Halogenid aus der aus Bromid, Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Haloperoxidase Lactoperoxidase ist und das Halogenid aus der aus Bromid, Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikrobiozid-Zusammensetzung weiters ein die antimikrobielle Aktivität verstärkendes Mittel der Formel:
umfasst, worin R_{1
Wasserstoff, eine unsubstituierte oder Hydroxy- oder Amino-substitu} ierte, unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und R₂ Wasserstoff oder eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel eine α-Aminosäure ist, die aus der aus Glycin und den l- oder d-Enantiomeren von Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Lysin, Phenylalanin, Tyrosin und Alkylestern davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikrobiozid-Zusammensetzung unter anaeroben Bedingungen gehalten wird, indem die Mikrobiozid-Zusammensetzung unter Druck in einen hermetisch abgedichteten Behälter gepackt wird, um sie als Flüssigkeit, Schaum oder Gel abzugeben.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikrobiozid-Zusammensetzung unter anaeroben Bedingungen gehalten wird, indem die Mikrobiozid-Zusammensetzung in ein greifbares Substrat imprägniert wird und das imprägnierte greifbare Substrat dann in einem geschlossenen Behälter hermetisch abgedichtet wird.
Hermetisch abgedichteter Behälter, der in einer Umgebung, die weniger als etwa 1.000 ppm Sauerstoff enthält, eine antimikrobielle Formulierung, die eine Haloperoxidase, ein Halogenid und ein Peroxid erzeugendes Mittel umfasst, das beim Einwirken von Sauerstoff Peroxid erzeugen kann, sowie Mittel zum Freisetzen der Formulierung aus dem Behälter umfasst.
Behälter nach Anspruch 13, worin die Haloperoxidase aus der aus Myeloperoxidase, Eosinophil-Peroxidase und Lactoperoxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Behälter nach Anspruch 13, worin das Halogenid aus der aus Chlorid, Bromid, Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Behälter nach Anspruch 13, worin das Peroxid erzeugende Mittel ein Enzym ist, das fähig ist, ein Substrat zu oxidieren und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zu reduzieren.
Behälter nach Anspruch 16, worin das Enzym Glucose-Oxidase ist und das Substrat Glucose ist.
Behälter nach Anspruch 13, worin die Haloperoxidase Myleoperoxidase ist.
Behälter nach Anspruch 13, worin die Haloperoxidase Eosinophil-Peroxidase ist und das Halogenid aus der aus Bromid, Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Behälter nach Anspruch 13, worin die Haloperoxidase Lactoperoxidase ist und das Halogenid aus der aus Bromid, Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Behälter nach Anspruch 13, worin das antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel die Formel:
aufweist, worin R₁ Wasserstoff, eine unsubstituierte oder Hydroxy- oder Amino-substituierte, unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und R₂ Wasserstoff oder eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist.
Behälter nach Anspruch 18, der zumindest 0,01 pMol/ml Myeloperoxidase in einem flüssigen Träger umfasst.
Behälter nach Anspruch 18, der 0,1 pMol/ml bis 500 pMol/ml Myeloperoxidase umfasst.
Behälter nach Anspruch 19, der zumindest 0,01 pMol/ml Eosinophil-Peroxidase in einem flüssigen Träger umfasst.
Behälter nach Anspruch 19, der 0,1 pMol/ml bis 500 pMol/ml Eosinophil-Peroxidase umfasst.
Behälter nach Anspruch 13, der 100 nMol/ml bis 300 pMol/ml Chlorid umfasst.
Behälter nach Anspruch 13, der 10 nMol/ml bis 50 pMol/ml Bromid umfasst.
Behälter nach Anspruch 13, der 1 nMol/ml bis 5 μMol/ml Iodid umfasst.
Behälter nach Anspruch 13, der eine Peroxid erzeugende Oxidase umfasst, die in Gegenwart eines Substrats der Oxidase wirksam 1 pMol bis 50 μMol Peroxid pro ml pro Minute erzeugt.
Behälter nach Anspruch 13, der Glucose-Oxidase umfasst, die in Gegenwart von D-Glucose wirksam 1 pMol bis 50 μMol Peroxid pro ml pro Minute erzeugt.
Hermetisch abgedichteter Behälter, der in einer Umgebung, die weniger als etwa 1.000 ppm Sauerstoff umfasst, eine durch Luft aktivierbare desinfizierende-sterilisierende Lösung, die Folgendes umfasst: (a) 0,1 pMol/ml bis 500 pMol/ml einer Haloperoxidase, die aus der aus Myeloperoxidase, Eosinophil-Peroxidase, Lactoperoxidase und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (b) ein Halogenid, das aus der aus 100 nMol/ml bis 300 μMol/ml Chlorid, 10 nMol/ml bis 50 μMol/ml Bromid, 1 nMol/ml bis 5 μMol/ml Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (c) 0,005 μMol/ml bis 50 μMol/ml einer α-Aminosäure, ausgewählt aus der aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin und Lysin bestehenden Gruppe und Alkylestern jeglicher Elemente dieser Gruppe; (d) 0,05 Einheiten/ml bis 10 Einheiten/ml eines Enzyms, das fähig ist, ein Substrat zu oxidieren und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zu reduzieren; und (e) 0,1 μMol/ml bis 10 μMol/ml eines Substrats für das Enzym; in einem flüssigen Träger; sowie Mittel zum Freisetzen der desinfizierenden-sterilisierenden Lösung aus dem Behälter umfasst.
Hermetisch abgedichteter Behälter, der in einer Umgebung, die weniger als etwa 1.000 ppm Sauerstoff umfasst, eine durch Luft aktivierbare ophthalmische Lösung, die Folgendes umfasst: (a) 0,1 pMol/ml bis 500 pMol/ml einer Haloperoxidase, die aus der aus Myeloperoxidase, Eosinophil-Peroxidase, Lactoperoxidase und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (b) ein Halogenid, das aus der aus 100 nMol/ml bis 300 pMol/ml Chlorid, 10 nMol/ml bis 50 pMol/m) Bromid, 1 nMol/ml bis 5 pMol/ml Iodid und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (c) 0,005 pMol/ml bis 50 pMol/ml einer α-Aminosäure, die aus der aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin und Lysin bestehenden Gruppe und Alkylestern jeglicher Elemente dieser Gruppe ausgewählt ist; (d) 0,05 Einheiten/ml bis 10 Einheiten/ml eines Enzyms, das fähig ist, ein Substrat zu oxidieren und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zu reduzieren; und (e) 0,1 pMol/ml bis 10 pMol/ml eines Substrats für das Enzym; in einem flüssigen Träger; sowie Mittel zum Freisetzen der ophthalmischen Lösung aus dem Behälter umfasst.