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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Verhüten von Fäulnis, Desinfizieren
oder Sterilisieren. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende
Erfindung auf Verfahren und Zusammensetzungen, die, solange sie
für die
Lagerung verpackt sind, inaktiv bleiben, wenn sie jedoch für die Verwendung
freigesetzt werden, durch Kontakt mit Luft als antiseptisches, desinfizierendes
oder sterilisierendes Mittel aktiv werden.
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Hintergrund
der Erfindung
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Antiseptik wird als eine deutliche
Verringerung mikrobieller Inhaltsstoffe definiert, während Desinfektion
die Eliminierung aller Lebensformen, die Krankheiten hervorrufen
können,
ist. Desinfektion bedeutet praktisch die Vernichtung sämtlicher
lebensfähiger
Mikroorganismen mit Ausnahme von Sporen. Sterilisation bedeutet
die vollständige
Eliminierung aller lebensfähigen
Mikroorganismen einschließlich
Sporen (J. V. Bennett, P. S. Brachman (Hrsg.), "Hospital Infections", 2. Aufl., 238–241 (1986)). Geeignete Verfahren
der Sterilisation, die derzeit verwendet werden, sind Autoklavierung
(mit Dampf unter Druck), trockene Hitze und Gassterilisation (z.
B. Ethylenoxid). Das Tränken
mit Antiseptika führt
normalerweise zu keiner vollständigen
Sterilisation und wird nur dann herangezogen, wenn die oben beschriebenen
Sterilisationsverfahren nicht angewendet werden können.
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Alle der oben beschriebenen Sterilisationsverfahren
haben ihre Grenzen. Viele Materialien und Vorrichtungen werden durch
Trockenhitze- oder Dampfsterilisation zerstört. Gassterilisation macht
ein längeres Kontaktieren,
z. B. Einwirkenlassen für
mehr als eine Stunde, und einen Zeitraum für die Dissipation des Gases aus
dem behandelten Material nach der Sterilisation erforderlich. Instrumente
mit Linsen oder poröse
Gegenstände
müssen
vor ihrer Verwendung typischerweise 24 bis 48 Stunden lang Luft
ausgesetzt werden. Die Sterilisation mit keimtötenden Mitteln wie Gluteraldehyd
(2%), Formaldehyd (8%) – Alkohol
(70%) oder Wasserstoffperoxid (6%) erfordert eine Einwirkzeit von
6 bis 18 Stunden. Diese keimtötenden
Mittel sind zudem hochgiftig und unterscheiden sich nicht in ihrer
toxischen Wirkung. Dadurch können
diese Sterilisationsmittel nicht direkt mit Wirtsgewebe in Kontakt
gebracht werden und können
nur begrenzt als Sterilisationsmittel für biomedizinische Vorrichtungen,
wie z. B. Kontaktlinsen, medizinische und chirurgische Instrumente,
und zum Reinigen von Wunden verwendet werden. Ein antimikrobielles
Mittel, das beispielsweise zum Desinfizieren oder Sterilisieren
einer Kontaktlinse eingesetzt wird, muss eine Anzahl an einzigartigen
Eigenschaften aufweisen. Einerseits muss es gegen Mikroorganismen
wirksam sein, die für
das Auge gefährlich
sein können.
Gleichzeitig muss es vom sensiblen Augenbereich des Kontaktlinsenträgers vertragen
werden und darf auch die Kontaktlinse selbst nicht beschädigen. Auf
dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Kontaktlinsen-Desinfektions-
und Aufbewahrungslösungen
bekannt. Solche Lösungen
verwenden üblicherweise
entweder Sorbinsäure,
Thimerosal, Chlorhexidin, ein polyquaternäres Germizid, ein synthetisches
Antibiotikum oder ein herkömmliches quaternäres Germizid,
wie z. B. Bezalkoniumchlorid. Diese herkömmlichen antimikrobiellen Mittel
weisen jedoch Nachteile auf, die sie in ihrer Verwendbarkeit einschränken. Sorbinsäure enthält z. B.
charakteristischerweise Formaldehyd-Rrückstände, Thimerosal wirkt bei manchen
Patienten als Allergie-Sensibilisator, und Chlorhexidin ist relativ
giftig. Ein weiters Problem besteht darin, dass weiche Kontaktlinsenmaterialien
dazu neigen, antimikrobielle Mittel sowie andere aktive Inhaltsstoffe,
die häufig
in Kontaklinsen-Pflegelösungen
enthalten sind, manchmal sogar bis zu gefährlichen Ausmaßen zu binden
und einzudicken. Benzalkoniumchlorid wird z. B. üblicherweise aufgrund seiner
Neigung, in die Linsenmatrix aufgenommen zu werden, nicht für weiche
Kontaktlinsen verwendet. Zusätzlich
sind viele der bis heute bekannten antimikrobiellen Mittel gegen
eine Anzahl von Pilzen und Hefen relativ unwirksam, die im Augenbereich
Probleme hervorrufen können.
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Die WO 91/11105 offenbart antimikrobielle
Zusammensetzungen, die Iodid-Anionen, Thiocyanat-Anionen, 1-Glucose
und ein Oxidoreduktase-Enzym, Glucose-Oxidase, um fassen. Die US-A-5.389.369
offenbart ein verbessertes System auf Haloperoxidase-Basis zum Abtöten von
Bakterien, Hefe- oder Sporen-Mikroorganismen, in dem die Mikroorganismen
in Gegenwart eines Peroxids und Chlorids oder Bromids mit einer
Haloperoxidase und einer die antimikrobielle Aktivität verstärkenden α-Aminosäure kontaktiert
werden. Obwohl festgestellt wurde, dass Zusammensetzungen und Verfahren
der US-A-5.389.369
hochwirksame antimikrobielle Mittel sind, müssen die Komponenten getrennt
gelagert und aufbewahrt werden, um eine Wechselwirkung von Haloperoxidase
und Peroxid sowie ein Aufbrauchen vor der Freisetzung zur Verwendung
zu verhindern.
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Es besteht daher Bedarf an Verfahren
und Zusammensetzungen zum Desinfizieren und/ oder Sterilisieren
von Materialien oder Vorrichtungen wie Kontaktlinsen, chirurgischen
Instrumenten und anderen biomedizinischen Vorrichtungen, die gegen
Bakterien, Pilze und Hefen wirksam sind, für den Anwender verträglich sind,
die Vorrichtungen nicht beschädigen
und so gestaltet sind, dass sie einfach und bequem gelagert und verwendet
werden können.
Idealerweise sollten derartige desinfizierenden-sterilisierenden
Zusammensetzungen schnell mit minimaler Wirtstoxizität und maximaler
keimtötender
Wirkung wirken. Die Zusammensetzungen sollten einfach abzugeben
sein und das behandelte Material oder die Vorrichtung sowie das
Wirtsgewebe, mit dem sie in Kontakt kommen, nicht schädigen. Abhängig von
der Stärke
der Zusammensetzung und dem Einwirkungszeitraum sollten die Zusammensetzungen
eine antiseptische, desinfizierende oder sterilisierende Wirkung
hervorrufen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegenden Erfindung beschreibt
Verfahren und Zusammensetzungen zum Herstellen von durch Luft aktivierbaren,
d. h. durch Sauerstoff (O2) aktivierbaren,
desinfizierenden-sterilisierenden Lösungen. Lösungen, die eine Haloperoxidase
(d. h. eine Halogenid : Wasserstoffperoxid-(H2O2-)Oxidoreduktase, wie z. B. Myeloperoxidase,
Eosinophil-Peroxidase
oder Lactoperoxidase) zusammen mit einem Halogenid oder einer Kombina tion
aus Halogeniden (d. h. Chlorid, Bromid und/oder Iodid) in geeigneten
Konzentrationen, eine Oxidase (d. h. eine Substrat : O2-Oxidoreduktase),
die H2O2 erzeugen
kann, und ein für
die Oxidase spezifisches Substrat enthalten, werden unter aeroben
Bedingungen getrennt hergestellt, wobei sämtliche der Lösungen in anaerobe
Lösungen
umgewandelt werden, bevor sie endgültig kombiniert und vermischt
werden. Die anaeroben Formulierungen werden in Behälter verteilt,
die dazu fähig
sind, die anaerobe Bedingung aufrechtzuerhalten (z. B. Druckkanister).
Das Abgeben der Lösung
zum Zeitpunkt der Verwendung bringt die Formulierung mit Luft (d.
h. O2) in Kontakt, wodurch deren desinfizierenden-sterilisierenden
Eigenschaften aktiviert werden. 02 ist die
geschwindigkeitsbegrenzende Komponente bei der Oxidase-Erzeugung
durch H2O2. Unter
aeroben Bedingungen katalysiert die Oxidase die Oxidation ihres
Substrats sowie die Reduktion von O2, um
H2O2 zu produzieren.
H2O2 wiederum dient
als Substrat für
die Haloperoxidase, die die Oxidation von Halogenid zu unterhalogeniger
Säure katalysiert.
Unterhalogenige Säure
reagiert mit einem zusätzlichen
H2O2, um ein Singulett-Sauerstoffmolekül (1O2) zu erzeugen.
Unterhalogenige Säure
(z. B. unterchlorige Säure)
und insbesondere 1O2 sind
wirksame mikrobiozide Mittel. Sowohl die Haloperoxidase-Erzeugung
von unterhalogeniger Säure
als auch deren Verbrauch in der Reaktion, um 1O2 zu erzeugen, sind von der Verfügbarkeit
von H2O2 abhängig. Eine
hohe Geschwindigkeit der H2O2-Erzeugung
führt zu
keiner Anhäufung
von unterhalogeniger Säure,
sondern stattdessen zu einer hohen 1O2-Produktion. Die Mikrobiozid-Kapazität und -Toxizität von 1O2 wird durch die
Halbwertszeit dieses metastabilen, elektronisch angeregten Reaktanden
begrenzt, und die desinfizierende-sterilisierende Aktivität ist als
solche zeitlich durch die Dynamik der Oxidans-Erzeugung definiert
und eingeschränkt.
Die desinfizierende-sterilisierende Aktivität einer Formulierung macht
das Einwirkenlassen von Luft erforderlich und ist von der Gegenwart
der verwendeten Halogenid-Haloperoxidase-Kombination, der Aktivität der vorhandenen
Oxidase, der Verfügbarkeit
von Oxidasespezifischem Substrat sowie von O2 abhängig.
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Für
diese desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen ist O2 die essentielle und begrenzende Komponente
in ihrer Mikrobiozid-Wirkung. Die Formulierung muss ausrei chend
Haloperoxidase enthalten, um den gewünschten Mikrobiozid-Effekt
hervorzurufen. Die relativen Konzentrationen der Oxidase und ihres
Substrats können
angepasst werden, um ein breites Spektrum an Mikrobiozid-Aktivitäten von
rascher, kurzzeitiger Mikrobiozid-Wirkung mit hoher Intensität bis hin
zu langsamer, längerer
Mikrobiozidsowie sporentötender
Wirkung. Durch ein Erhöhen
der Oxidase und indem das Oxidase-Substrat konzentrationsbegrenzend
gemacht wird, wandelt die Formulierung Substrat rasch in H2O2 um, wodurch eine
hochwirksame aber zeitlich begrenzte Mikrobiozid-Wirkung erzeugt wird. Wenn das Substrat
aufgebraucht ist, kommt es zu einem Ende der oxidativen Aktivität. Andererseits
wird durch ein Einschränken
der Oxidase-Konzentration auch die Geschwindigkeit der H2O2-Generation begrenzt
und es kommt zu einer langsamen aber anhaltenden Mikrobiozid-Wirkung.
Die Oxidase-Konzentration beschränkt
die Geschwindigkeit der H2O2-Produktion,
und die Substrat-Konzentration beschränkt die Quantität und Dauer
der H2O2-Produktion.
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Haloperoxidasen besitzen eine sehr
hohe Mikrobiozid-Kapazität
und eine geringe Wirtsgiftigkeit. Diese Eigenschaften stellen zusammen
mit der Fähigkeit,
die zeitlich Dynamik der desinfizierenden-sterilisierenden Aktivität formulieren
zu können
(d. h. die Fähigkeit,
die Zeitdauer oder das Zeitfenster der maximalen Mikrobiozid-Wirkung
steuern zu können)
eine hervorragende chemische sterilisierende Aktivität sowie
minimale Wirtsgiftigkeit sicher. Wenn keine Substrate vorhanden
sind, zeigen Haloperoxidasen keine direkte Toxizität bei Säugetierzellen.
Die Haloperoxidase-Oxidations- und -Oxigenierungsaktivität sind funktionell
mit der Verfügbarkeit
von H2O2 verknüpft. Als
solches können
Materialien oder Vorrichtungen (z. B. Endoskopierohr), die mittels
dieser Haloperoxidase-Formulierungen sterilisiert worden sind, unmittelbar
nach der Sterilisation mit dem Wirtsgewebe in direkten Kontakt gebracht
werden.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
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Gemäß vorliegender Erfindung werden
Verfahren zum Abtöten
oder Hemmen des Wachstums von Mikroorganismen bereitgestellt, die
folgende Schritte umfassen:
- (a) das Halten
einer Mikrobiozid-Zusammensetzung, die eine Haloperoxidase, ein
Halogenid und ein Peroxid erzeugendes Mittel umfasst, das fähig ist,
beim Einwirken von Sauerstoff Peroxid zu erzeugen, in einer Umgebung,
die weniger als etwa 1.000 ppm Sauerstoff umfasst;
- (b) das Einwirkenlassen von Sauerstoff auf die Zusammensetzung,
um die Mikrobiozid-Aktivität
der Zusammensetzung zu aktivieren; und
- (c) das Kontaktieren der Mikroorganismen mit der aktivierten
Zusammensetzung, um die Mikroorganismen abzutöten oder ihr Wachstum zu hemmen.
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Die Komponenten werden vorzugsweise
hergestellt, vereinigt und anaerob gelagert (d. h. unter relativer
Abwesenheit von Sauerstoff). Die anerobe Formulierung bleibt solange
inaktiv, bis sie bei ihrer Anwendung Luft ausgesetzt wird. Das Einwirkenlassen
von Luft stellt Sauerstoff, die geschwindigkeitsbegrenzende Komponente
für die
Mikrobiozidwirkung, zur Verfügung,
um die Formulierung dazu zu aktivieren, das Wachstum von Mikroorganismen
abzutöten
oder zu hemmen.
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In einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung sind hermetisch abgedichtete Behälter oder Verpackungen bereitgestellt,
die die Fähigkeit
einer Formulierung, die eine Haloperoxidase, ein Halogenid und ein Peroxid
erzeugendes Mittel umfasst, durch das Einwirkenlassen von Luft Peroxid
erzeugen zu können,
aufrechterhalten. Es werden Mittel zum Abgeben der Formulierung
aus dem Behälter
oder der Verpackung bereitgestellt, wodurch die Formulierung durch
das Einwirken von Luft aktiviert wird und das Wachstum von Mikroorganismen
abtöten
oder hemmen kann.
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Der hierin verwendete Begriff „anaerob" oder „im Wesentlichen
anaerob" bezeichnet
im Wesentlichen anaerobe Bedingungen, die weniger als etwa 1000
ppm Sauerstoff, vorzugsweise weniger als etwa 500 ppm Sauerstoff,
und insbesondere weniger als etwa 250 ppm Sauerstoff umfassen.
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Haloperoxidasen, die in der vorliegenden
Erfindung nützlich
eingesetzt werden, sind als Halogenid : Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktasen
definiert (z. B. EC Nr. 1.11.1.7 und EC Nr. 1.11.1.10 nach der Nomenklatur
der International Union of Biochemistry), bei denen Halogenid der
Elektronenspender oder -reduktor und Peroxid der Elektronenempfänger oder
-oxidator ist. Jede beliebige Haloperoxidase, die die Halogenid-abhängige Erzeugung
von Singulett-Sauerstoffmolekülen
aus Wasserstoffperoxid katalysiert, kann in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Geeignete Haloperoxidasen schließen Myeloperoxidase
(MPO), Eosinophil-Peroxidase (EPO), Lactoperoxidase (LPO), Chlorperoxidase
(CPO) und Derivate davon ein, wobei die derzeit bevorzugten Haloperoxidasen
Myeloperoxidase und Eosinophil-Peroxidase sind. Unter „Derivaten
davon" sind hierin
im Allgemeinen chemisch oder funktionell modifizierte MPO, EPO,
CPO und LPO zu verstehen, die sich spezifisch an Zielmikroorganismen
oder spezifisch eukaryotische Zelltypen binden können und die Haloperoxidase-Aktivität zurückhalten,
um die Disproportionierung von Peroxid zu verstärken, um in der Gegenwart eines
geeigneten Halogenids Singulett-Sauerstoffmoleküle auszubilden, wie hierin
beschrieben wird.
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Für
die Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
geeignete Halogenide schließen
Bromid, Chlorid und/oder Iodid ein. Die Verwendung, Auswahl und
Menge des in einer bestimmten Anwendung eingesetzten Halogenids
hängt von
verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. der in der antiseptischen Zusammensetzung
verwendeten Haloperoxidase, der gewünschten antiseptischen, desinfizierenden
oder sterilisierenden Wirkung und andere Faktoren. Wenn die Haloperoxidase
MPO oder CPO ist, kann das Halogenid Bromid oder Chlorid sein. Die
Menge an verwendetem Chlorid bewegt sich vorzugsweise im Bereich
von etwa 10 μMol
Chlorid bis etwa 150 μMol
Chlorid pro ml an Lösung,
um sich physiologischen Bedingungen anzunähern. Wenn als Haloperoxidase
EPO oder LPO verwendet werden, ist Chlorid als Kofaktor relativ
unwirksam, und dementsprechend wird Bromid bevorzugt als Halogenid
herange zogen. Sind diese in flüssigen
Zusammensetzungen enthalten, so können die Zusammensetzungen
der Erfindung von etwa 1 nMol Bromid bis etwa 50 μMol Bromid
pro ml an flüssiger
Zusammensetzung, vorzugsweise von etwa 10 nMol Bromid bis etwa 10 μMol Bromid
pro ml an flüssiger
Zusammensetzung, und insbesondere von etwa 100 nMol Bromid bis etwa
1 μMol Bromid
pro ml flüssiger
Zusammensetzung enthalten.
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In Gegenwart von ausreichend Halogenid
ist H
2O
2 das geschwindigkeitsbegrenzende
Substrat für
die Haloperoxidase-Mikrobiozid-Wirkung. Die Mikrobiozid-Aktivität ist mit
der Erzeugung unterhalogeniger Säure durch
Haloperoxidase:
und der darauf folgenden
Erzeugung von Singulett-Sauerstoffmolekülen (
1O
2) verbunden:
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Sowohl HOX als auch 1O2 sind wirksame antimikrobielle Reaktionspartner.
Da für
die HOX-Erzeugung H2O2 benötigt wird,
und H2O2 mit HOX
umgesetzt wird, um 1O2 zu
erzeugen, garantiert das Haloperoxidase-System, dass sich das HOX
nicht anhäufen
wird sondern weiter umgesetzt wird, um 1O2, ein metastabiles, elektronisch angeregtes
Molekül
mit hoher Reaktionsbereitschaft aber begrenzter Lebensdauer, zu
erzeugen.
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Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden
Erfindung besteht darin, dass die Komponenten des Haloperoxidase-Systems
solange unter anaeroben Bedingungen gehalten werden können, bis
sie für
die Verwendung bereit sind, und dann durch Einwirkenlassen von Sauerstoff
aktiviert werden können.
Diese Eigenschaft der Sauerstoff- oder Luftaktivierbarkeit der vorliegenden
Erfindung resultiert daraus, dass in der Formulierung ein Sauerstoff-abhängiges,
Peroxid erzeugendes Mittel eingeschlossen ist, das beim Einwirken
von Sauerstoff aus der Luft Peroxid produziert. Geeignete Sauerstoff-abhängige, Peroxid erzeugende
Mittel schließen
beliebige chemische Systeme ein, die durch das Einwirken von O2 Peroxid erzeugen können, vorausgesetzt, dass das
System nicht die Haloperoxidase-Funktion hemmt, das zu desinfizierende
oder zu sterilisierende Material oder die Vorrichtungen nicht beschädigt und
in den verwendeten Konzentrationen auf Säugetiergewebe nicht toxisch
wirkt. In einer derzeit besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Peroxid erzeugende Mittel: (a) eine Oxidase (Substrat
: O2-Oxidoreduktase) und (b) ein für die Oxidase
spezifisches Substrat. Oxidasen sind Substrat-spezifische Enzyme,
die beim Einwirken von O2 H2O2 gemäß der Reaktion
(3) erzeugen:
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Da die H2O2-Produktion sowohl vom Oxidase-spezifischen
Substrat als auch von O2 abhängig ist,
sind Oxidasen in der praktischen Anwendung der Erfindung besonderes
nützlich.
Für diesen
Zweck repräsentative Oxidasen
(zusammen mit ihren zugehörigen
Substraten) schließen,
jedoch nicht ausschließlich,
Glykolat-Oxidase, Glucose-Oxidase, Galactase-Oxidase, Hexose-Oxidase,
Cholesterin-Oxidase, Aryl-Alkohol-Oxidase, L-Gulonolaceton-Oxidase,
Galactose-Oxidase, Pyranose-Oxidase, L-Sorbose-Oxidase, Pyridoxin-Oxidase, Alkohol-Oxidase,
L-1-Hydroxysäure-Oxidase,
Ecdysom-Oxidase, Cholin-Oxidase,
Aldehyd-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Pyruvat-Oxidase, Oxalat-Oxidase,
Glyoxylat-Oxidase, Pyruvat-Oxidase, D-Aspartat-Oxidase, L-Aminosäure-Oxidase,
Amin-Oxidase, Pyridoxaminphosphat-Oxidase, D-Glutamat-Oxidase, Ethanolamin-Oxidase,
Tyramin-Oxidase, Putrascin-Oxidase, Sarcosin-Oxidase, N-Methylaminosäure-Oxidase,
N-Methyllysin-Oxidase,
Hydroxylnicotin-Oxidase, Glycerin-3-phosphat-Oxidase, Nitroethan-Oxidase,
Acetylindoxyl-Oxidase, Urat-Oxidase, Hydroxylamin-Amin-Oxidase und
Sulfit-Oxidase ein. Oxidasen, die radikalische Hydrodioxylsäure (HO2) und ihre konjugierte Base Superoxid (O2) erzeugen, können ebenfalls verwendet werden.
Diese radikalischen Zwischenprodukte disproportionieren letztendlich,
um H2O2 zu erzeugen.
Wenn die Oxidase und ihr Substrat unter aeroben Bedingungen gehalten
werden, sind sie inaktiv, da kein O2 zur
Verfügung
steht, um sich an der Oxidase/Substrat-Reaktion (1) zu beteiligen.
Daher wird kein H2O2 erzeugt,
bis die Formulierung ihrer geschwindigkeitsbegrenzenden Komponente
O2 ausgesetzt wird.
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Mittel, die durch das Einwirken von
Sauerstoff Wasserstoffperoxid erzeugen können, wie z. B. Peroxid erzeugende
Oxidasen, sind auch für
die dynamische Steuerung der an der Stelle der antimikrobiellen
Aktivität vorhandenen
Wasserstoffperoxid-Mengen besonders nützlich. Solche Mittel maximieren
die antimikrobielle Aktivität
der Zusammensetzung, indem sie eine konstante, niedrige H2O2-Konzentration
vorsehen und aufrechterhalten. Dementsprechend hängt die an solchen Mitteln
verwendete Menge stark von der Eigenschaft des Mittels und der gewünschten
Wirkung ab, ist jedoch vorzugsweise dazu fähig, eine konstante Menge von etwa
1 pMol bis etwa 1 μMol
an Wasserstoffperoxid pro ml Flüssigkeit
pro min zu erzeugen, je nach Art und Konzentration des an der Stelle
antimikrobieller Aktivität
vorhandenen Halogenids. Wenn die Formulierung als desinfizierende-sterilisierende
Lösung
verwendet wird, können
die Oxidase und ihr Substrat so angepasst werden, dass sie für die Dauer
des benötigten
Sterilisationszeitraums eine relativ hohe, konstante Konzentrationen
an H2O2 bereitstellen.
Die desinfizierende-sterilisierende Wirkung endet, wenn das Oxidase-Substrat
aufgebraucht ist, oder relativ zur Abbaugeschwindigkeit der Oxidase.
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Optional kann die antimikrobielle
Aktivität
der Formulierungen der Erfindung gegen Hefe- und Sporenmikroorganismen
verbessert werden, indem ein geeignetes die antimikrobielle Aktivität verstärkendes
Mittel, wie es in der US-A-5.389.369 offenbart wird, deren Offenbarung
hierin durch Verweis aufgenommen ist, in die Formulierung aufgenommen
wird. Im Allgemeinen sind geeignete die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel
Komponenten, die die antimikrobielle Aktivität des antimikrobiellen Haloperoxidase-Systems gegen Hefe- und
Sporenmikroorganismen verstärken,
indem sie die Hefe- und Sporenformen der Mikroorganismen durch die
Haloperoxidase-Mikrobiozid-Aktivität labilisieren, und die keine
nachteiligen Auswirkungen auf die Haloperoxidase-Aktivität des Systems
oder unerwünschte
Auswirkungen auf den Anwendungsbereich haben. Derzeit bevorzugte
die Aktivität
verstärkende
Mittel der Erfindung umfassen α-Aminosäure-Zusammensetzungen
der Formel:
worin R
1 Wasserstoff,
eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen
oder eine unsubstituierte oder Hydroxy- oder Amino-substituierte,
unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen
ist und R
2 Wasserstoff oder eine unverzweigte
oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist. Die hierin
verwendeten Aminosäuren
können
in Form ihrer Säure,
wie oben dargestellt, oder in ihrer Zwitterionenform vorliegen,
die durch die Formel:
dargestellt ist, worin R
1 und R
2 die oben
erläuterten
Bedeutungen haben, und können
entweder in ihrer l- oder d-Enantiomer-Konfiguration vorliegen.
Repräsentative
R
1-Alkylgruppen sind beispielsweise Methyl-,
Hydroxymethyl-, Isopropyl-, 2-Isobutyl-, 1-Isobutyl-, Hydroxyethyl-
und Aminobutyl-Gruppen. Repräsentative
R
1-Arylalkylgruppen sind beispielsweise
Tolyl- und Hydroxytolyl-Gruppen. Repräsentative, die antimikrobielle
Aktivität verstärkende Mittel
der Erfindung umfassen α-Aminosäuren, die
aus der aus Glycin und den l- oder d-Enantiomeren von Alanin, Valin,
Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Lysin, Phenylalanin, Tyrosin
und den Alkylestern davon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Die derzeit besonders bevorzugten, die antimikrobielle Aktivität verstärkenden
Mittel sind Glycin und l-Alanin.
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Gemäß anderen Aspekten der Erfindung
können
anaerobe Formulierungen, die Oxidase, Oxidase-spezifisches Substrat,
Halogenid und Haloperoxidase enthalten, formuliert werden und bei
Umgebungstemperatur für
eine langfristige Lagerung verpackt werden. Derartige Formulierungen
rufen bei Lufteinwirkung eine starke Mikrobiozid-Wirkung hervor.
Darüber
hinaus können
O2-aktivierbare, desinfizierende-sterilisierende
Zusammensetzungen formuliert werden, um unterschiedlich starke Wirkungen
und unterschiedliche Aktivitätszeiträume zu erreichen.
Wie aus der obigen Gleichung (1) abgeleitet werden kann, ist die
Geschwindigkeit der H2O2-Generation
von der Oxidase-Kon zentration abhängig, während die Menge an erzeugtem
H2O2 proportional
zur vorhandenen Substratmenge ist. Wenn das Substrat nicht begrenzend
wirkt, ist die Geschwindigkeit der H2O2-Erzeugung direkt proportional zur Oxidase-Aktivität. Wenn
die Oxidase-Aktivität
nicht begrenzend wirkt, ist die Menge und Dauer der H2O2-Erzeugung abhängig von der Verfügbarkeit
des Oxidase-spezifischen Substrats. Wird eine hochwirksame, kurzzeitige
desinfizierende-sterilisierende Wirkung gewünscht, sollte die Formulierung
eine geeignete Haloperoxidase und ein geeignetes Halogenid sowie
relativ hohe Oxidase-Aktivität
aufweisen, wobei ausreichend Substrat vorhanden sein muss, um die
Aktivität
auf den gewünschten
Zeitrahmen zu begrenzen. Eine weniger starke, jedoch lang andauernde
sterilisierende Wirkung kann mit einer geeigneten Haloperoxidase
und einem geeigneten Halogenid, relativ geringer Oxidase-Aktivität und einer
ausreichenden Menge an Substrat formuliert werden, um die Reaktion
für den
gewünschten
Zeitraum aufrechtzuerhalten. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt
wird, sind Systeme dieser Art formuliert worden, um eine Mikrobiozid-Sporizid-Wirkung
zu erzielen, die für
einen Zeitraum von zwei Tagen nach Lufteinwirkung anhält.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
werden die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung als antiseptische
Mittel eingesetzt, die eine verstärkte Haloperoxidase-Aktivität gegen
Sporen und Hefe aufweisen und gegen eine Vielzahl von pathogenen
Mikroorganismen einschließlich
Bakterien und Pilzen wirken. Um für den Kontakt mit Wirtsgewebe
verwendet werden zu können,
basieren die antiseptischen Systemen auf der Verwendung von dioxygenierenden
Haloperoxidase-Enzymen, die eine selektive Affinität für pathogene
Mikroorganismen aufweisen. Als solche kann die hochwirksame Mikrobiozid-Wirkung
auf die Zielmikroorganismen ausgerichtet werden, ohne dass damit
verbundenes Wirtsgewebe oder die normale Flora zerstört wird;
d. h. die antiseptische Wirkung ist selektiv und auf die Zielmikroorganismen
begrenzt.
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Die Hyloperoxidase-Verstärkungszubereitungen
können,
wenn richtig formuliert, dazu verwendet werden, Materialien und
Vorrichtungen zu desinfizieren und sogar zu sterilisieren. Hochwirksame
Haloperoxidase-Verstärkungsformulierungen
können
als in vitro Desinfektions- oder Sterilisationszubereitungen dienen. Durch
die Begrenzung des Zeitraums, in dem Wasserstoffperoxid zur Verfügung steht,
können
Haloperoxidase-Verstärkungsformulierungen
wirksam genug gemacht werden, um eine Desinfizierung und sogar eine
Sterilisation eines Materials oder einer Vorrichtung sicherzustellen,
bevor dieses mit dem Wirtsgewebe in Kontakt kommt. Jede mögliche toxische
Wirkung auf die normale Flora und das Wirtsgewebe, die mit der Verwendung solch
hochwirksamer Formulierungen verbunden ist, lässt nach, wenn das Peroxid
aufgebraucht ist, und das mit der Formulierung behandelte Material
oder Vorrichtung kann ohne zusätzliches
Abwaschen zur Entgiftung mit dem Wirtsgewebe in Konakt gebracht
werden.
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In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung sind die Zusammensetzungen der Erfindung speziell für In-Vitro-Anwendungen,
wie z. B. zum Desinfizieren oder Sterilisieren von medizinischen
Geräten,
Kontaktlinsen und dergleichen, insbesondere für Anwendungen, bei denen die
Vorrichtungen oder Linsen im Kontakt mit einem Patienten oder Träger verwendet
werden sollen, ausgebildet. Für
derartige Anwendungen können die
Zusammensetzungen bequem in Form einer Flüssigkeit oder eines Schaums
bereitgestellt werden und können
mit Emulgatoren, Tensiden, Puffern, Netzmitteln, Konservierungsmitteln
und anderen häufig
in solchen Zusammensetzungen vorzufindenden Komponenten versetzt
sein. Die Zusammensetzungen der Erfindung können in absorbierende Materialien,
wie z. B. Nähte,
Verbände
und Gaze, imprägniert
werden oder auf die Oberfläche
von Festphasenmaterialien, wie z. B. Klammern, Reißverschlüsse und
Katheter aufgezogen werden, die verpackt und unter im Wesentlichen
anaeroben Bedingungen aufbewahrt werden, wie z. B. in versiegelten
Folien und/oder luftundurchlässigen
Polymerbeuteln oder -taschen. Die Taschen oder Beutel können dann
geöffnet
werden, um die Zusammensetzungen an eine Stelle zuzuführen, um
dort mikrobieller Infektion vorzubeugen. Andere Zufuhrsysteme dieser
Art sind für
Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich.
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Die tatsächlichen Mengen an Haloperoxidase,
Halogenid, Peroxid erzeugendem Mittel und/oder die antimikrobielle
Aktivität
verstärkende
Mittel in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden, so dass
an der zu behandelnden Stelle Mengen an Haloperoxidase und die antimikrobielle
Aktivität
verstärkende
Mittel vorhanden sind, die vegetative Mikroorganismen sowie Hefe-
und Sporenmikroorganismen wirksam abtöten können. Dementsprechend sind
die gewählten
Mengen von der Art sowie dem Ort der Behandlungsstelle, der erwünschten
Reaktion, der gewünschten
Dauer der Mikrobiozid-Wirkung und anderen Faktoren abhängig. Wenn
als Haloperoxidase Myeloperoxidase, Esinophil-Peroxidase, Lactoperoxidase
oder Zusammensetzungen davon verwendet werden, umfassen die flüssigen Zusammensetzungen
der Erfindung im Allgemeinen zumindest 0,01 Picomol (pMol) Haloperoxidase
pro ml flüssiger
Zusammensetzung, vorzugsweise von etwa 0,1 pMol bis etwa 500 pMol
Haloperoxidase pro ml flüssiger
Zusammensetzung, und insbesondere etwa 0,5 pMol bis etwa 50 pMol
Myeloperoxidase pro ml flüssiger
Zusammensetzung. Optional kann es bei manchen Anwendungen erwünscht sein,
sowohl Eosinophil-Peroxidase und Myeloperoxidase in derselben Zusammensetzung
einzuschließen.
Flüssige
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen im Allgemeinen zudem 100
pMol/ml bis 300 pMol/ml Chlorid, 10 pMol/ml bis 50 pMol/ml Bromid,
1 pMol/ml bis 5 pMol/ml Iodid oder Kombinationen davon. Optional
können
flüssige
Zusammensetzungen der Erfindung im Allgemeinen zumindest 0,005 pMol/ml
an die an antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel, d. h. α-Aminosäuren wie
z. B. Glycin und Alanin, und vorzugsweise 0,05 pMol/ml bis 50 pMol/ml
solcher die antimikrobielle Aktivität verstärkende Mittel umfassen. Zuletzt
können
flüssige
Zusammensetzungen der Erfindung im Allgemeinen 0,05 bis 10 Einheiten/ml
an Enzym, wie z. B. Glucoseoxidase, das dazu fähig ist, ein Substrat zu oxidieren,
wie z. B. Glucose, und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zu reduzieren.
Zusätzlich
können
auch von 0,1 bis 10 pMol/ml an Substrat für das Enzym enthalten sein.
Die vorher genannten Komponenten werden üblicherweise in einem pharmazeutisch
annehmbaren flüssigen
Träger
vereinigt.
-
Zur Veranschaulichung kann eine Zusammensetzung,
die als Kontaktlinsenlösung
verwendet werden kann, beispielsweise 1 bis 20 pMol/ml Eosinophil-Peroxidase
und/oder Myeloperoxidase, 0,1 bis 10 pMol/ml Glycin, 0,01 bis 10
Einheiten Glucoseoxidase und 50 bis 300 mÄqu./l Chlorid mit 0,1 bis 5
mÄqu./l
Bromid umfassen. Die obige Zusammensetzung wird unter anaeroben
Bedingungen mit 0,1 bis 10 μMol/ml
Glucose vereinigt, und die gesamte Zubereitung wird bis zur Verwendung
als flüssige
Desinfektions- oder Sterilisationslösung anaerob gehalten. Das
Einwirkenlassen von Luft, d. h. molekularem Sauerstoff, aktiviert
die desinfizierende-sterilisierende Wirkung der Formulierung.
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Aufgrund der selektiven Bindungskapazitäten von
Myeloperoxidase und Eosinophil-Peroxidase wirken selbst hochwirksame
Formulierungen nur geringfügig
toxisch auf Säugetiergewebe.
Darüber
hinaus verringert die Fähigkeit,
den Zeitraum maximaler Wirksamkeit zeitlich begrenzen zu können, das
Wirtstoxizitätspotential weiters,
indem die Zeitdauer hochwirksamer Desinfektion-Sterilisation auf
die Zeit vor dem Kontakt mit dem Wirt beschränkt wird. Ein Material oder
eine Vorrichtung, die mit dem Desinfektions-Sterilisationsmittel behandelt worden
ist, kann daher nach dem Sterilisationszeitraum in direkten Kontakt
mit dem Wirtsgewebe gebracht werden.
-
Dieser sowie andere Aspekte der Erfindung
werden in Verbindung mit den folgenden Beispielen, die zu Veranschaulichungszwecken,
jedoch nicht als Einschränkung
angeführt
werden, besser verständlich.
-
Beispiel 1
-
Anaerobe Formulierung
mit Mikrobiozid-Aktivität
bei Lufteinwirkung
-
Als anaerobe Kammer wurde eine gasundurchlässige Glove
Box vorbereitet, indem diese zuerst mit Stickstoff begast wurde
(N2, 99,99% sauerstofffrei). Nachdem der
Prozentanteil an O2 auf 0,1% gefallen war, wurden
5 anaerobe Gas-Packungen geöffnet
und in der Kammer aktiviert. Folgende Lösungen und Bakteriensuspension
wurden zubereitet und in die anaerobe Kammer gegeben:
- (a1) Glucose-Oxidase (GOX), präpariert
aus Typ-VII-Aspergillus-niger-GOX (Sigma Chemicals).
- (a2) Acetatpuffer ohne GOX.
- (b) Myeloperoxidase-Lösung
(MPO, Chargennr. 1899201, ExOxEmis Inc.), die D-Glucose, Chlorid
und eine sehr geringe Menge an Bromid enthielt.
- (c) Suspension von Staphylococcus aureus.
-
Als sich die Sauerstoffkonzentration
zwischen 0,01 und 0,02%, d. h. 100 bis 200 ppm, stabilisiert hatte, wurde
die Lösung
(a1) oder die Lösung (a2)
mit (b) vermischt, und ein Teil jedes Gemischs sowie ein Teil der Bakteriensuspension
(c) wurde aus der Kammer entfernt. Nach etwa 10 min wurde die Bakteriensuspension den
aeroben bzw. anaeroben Gemischen mit GOX (a1)
und ohne GOX (a2) beigemengt. Die endgültigen Lösungen enthielten
entweder 0,6 Einheiten GOX oder kein GOX, 56 μMol D-Glucose, 5 pMol MPO und
etwa 3 × 107 Staphylococcus aureus-Bakterien pro ml
von 50 mM Acetatpuffer mit 100 mÄqu./l
Cl– und
1 mÄqu./l
B–, pH
6, bei Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein
von Luft (Umgebungssauerstoff). Aus den Testlösungen wurden nach 1,25, 2,5,
5, 10 und 20 min Proben (100 μl
gemischte Suspension) gezogen, die umgehend mit 0,9 ml an 0,1%igem
Thioglykolat mit 200 Einheiten Katalase (Sigma Chemicals) verdünnt wurden,
um das oxidative Abtöten
zu beenden. Die Proben wurden weiter verdünnt und auf Trypticase-Soja-Agar
aufgebracht (Hockeystock-Verfahren). Die Bakterienkolonien wurden
nach einer Inkubationszeit von 1 bis 2 Tagen bei 37°C gezählt, und
die Staphylococcus aureus-Überlebensrate
ist, wie in Tabelle 1 angeführt,
als koloniebildende Einheiten (CFU, "colony forming units") pro ml ursprünglicher Suspension angegeben.
In Tabelle 1 und den nachfolgenden Beispielen steht 0 für kein Wachstum
bei der geringsten getesteten Verdünnung, d. h. weniger als 100
CFU.
-
Tabelle
1
Sauerstoff-abhängiges
Abtöten
von Staphylococcus aureus
-
Vollständige Abtötung des Staphylococcus aureus
wurde beim kompletten GOX-MPO-System
in Gegenwart von O2 beobachtet. Obwohl beim
Nicht-Vorhandensein von 02 in den ersten
5 min im GOX-MPO-Vollsystem keine Abtötung beobachtet werden konnte,
kam es nach einer Einwirkung von 10 und 20 min zu einer unvollständigen Abtötung. Diese
unvollständige
Abtötung
lässt sich
durch die Tatsache erklären,
dass die anaerobe Kammer immer noch 0,01 bis 0,02% O2 enthielt.
Obwohl die Sauerstoffkonzentration in der aneroben Kammer nur etwa
einem Tausendstel jener der Luft entspricht, reicht diese Menge
an O2 aus, um eine partielle Mikrobiozid-Wirkung
auszulösen.
Beim MPO-Alleinsystem (ohne GOX) konnte weder beim Vorhandensein noch
beim Nicht-Vorhandensein
von O2 eine Abtötung beobachtet werden.
-
Beispiel 2
-
Anaerobe Zubereitung und
O2-Aktivierung der Mikrobiozid-Sporizid-Aktivität hochwirksamer
MPO- und EPO-basierter Formulierungen
-
Die anaerobe Kammer wurde wie in
Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch die die GOX-XPO-Formulierung umfassenden Komponenten
verändert
wurden und Glycin zugegeben wurde, um eine Sporizid-Wirkung wie
in der US-A-5.389.369 (Allen) zu ermöglichen. Zwei unterschiedliche
Formulierungen wurden anaerob zubereitet. Die erste Formulierung
enthielt 0,5 Einheiten GOX (Typ-VII-Aspergillus-niger-GOX, Sigma
Chemicals) plus 56 μMol
D-Glucose, 30 pMol MPO (vom Schwein, Chargennr. 1899201, ExOx-Emis, Inc.) und 2 μMol Glycin
pro ml von 50 mM Acetatpuffer mit 100 mÄqu./l Cl– und
1 mÄqu./l
Br–,
pH 6. Die zweite Formulierung war gleich, abgesehen davon, dass
MPO durch 30 pMol EPO (Chargennr. 1929201, ExOxEmis Inc.) ersetzt wurde.
Beide Formulierungen wurden anschließend vor dem Testen für mehr als
eine Woche anaerob altern gelassen.
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Die Mikrobiozid-Kapazität der GOX-MPO-Glycin-Formulierung
wurde nach 12 Tagen anaerober Lagerung untersucht. Wie in Tabelle
2 angeführt
wurde die Formulierung auf einen breiten Bereich an gramnegativen
und grampositiven Bakterien, Hefe- und Pilzsporen hin getestet.
Bei jeder Prüfbedingung
wurden 400 μl der
GOX-MPO-Glycin-Formulierung und 200 μl Mikroben-Suspension herangezogen,
die durch Einwirkenlassen von Luft (Umgebungssauerstoff) aktiviert
wurden. Die Proben wurden nach 0, 5, 10 und 20 min Inkubation (für die Bakterien)
und nach 20, 30 , 60 und 90 min Inkubation (für die Hefe- und Pilzsporen)
entnommen, umgehend mit 0,9 ml 0,1%igem Thioglykolat mit 200 Einheiten
Katalase verdünnt
und auf Tripticase-Soja-Agar (Bakterien) bzw. Sabouraud-Dextrose-Agar
(Hefe und Pilze) aufgebracht. Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 4
Tagen bei 37 °C
wurden die Kolonien gezählt.
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Die MPO-Konzentration (18 pMol/ml,
zuletzt) der Formulierung tötete
alle getesteten gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich Streptokokken
der Gruppe A, wirksam ab. Die Abtötung war nach einer Einwirkung
von 5 bis 20 min vollendet. die Formulierung tötete zudem die getesteten Hefe-
und Pilzsporen wirksam ab, wobei jedoch für vollständige Abtötung ein längeres Einwirkenlassen, d.
h. 30 bis 90 min, nötig war.
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Tabelle
2
Anaerobe versus Aerobe Mikrobiozid-Wirkung der GOX-MPO-Glycin-Formulierung
0,3
Einheiten GOX, 18 pMol MPO & 1 μMol Glycin
(Reaktionsendkonz. pro ml)
-
Die Mikrobiozid-Kapazität der GOX-EPO-Glycin-Formulierung
wurde nach 13 Tagen anaeober Lagerung untersucht. Die EPO-basierte
Formulierung wurde unter denselben Testbedingungen auf dieselben
Mikroben getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.
-
Die EPO-basierte Formulierung war
gleich wirksam wie die vorher untersuchte MPO-basierte Formulierung
und wirkte schneller. Bei der gegebenen EPO-Konzentration (18 pMol/ml,
zuletzt) waren sämtlich
gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich Gruppe-A-Streptokokken
nach einer Einwirkzeit von 5 min vollständig abgetötet. Die Abtötung von
Candida albicans und Fusarium moniliforme war ebenso nach 90 min
abgeschlossen.
-
Tabelle
3
Anaerobe versus Aerobe Mikrobiozid-Wirkung der GOX-EPO-Glycin-Formulierung
0,3 Einheiten GOX, 18 pMol EPO & 1
pMol Glycin (Reaktionsendkonz. pro ml)
-
-
Beispiel 3
-
Zubereitung und Testen
von O2-aktivierten Mikrobiozid-Sporizid-Formulierungen
in Drucksprühdosen
-
Zubereitung des Sprühsterilisatormittels:
-
Zubereitung von Stammlösungen:
Eine 10%ige (Vol./Vol.) Tween 80 Lösung wurde durch Zugabe von 10
ml Tween 80 zu 90 ml H2O hergestellt. Eine
1%ige (Gew./Vol.) EDTA-Lösung
wurde durch Zugabe von 1 g Na2EDTA zu 100
ml H2O hergestellt. Eine 0,1 M Glycin-Lösung wurde
durch Zugabe von 1,5 g Glycin (MG = 75) zu 200 ml H2O
hergestellt. Eine 0,5%ige (Gew./Vol.) Hydroxypropyl-Methyl-Cellulose-Lösung (HPMC,
100 Centipoise) wurde durch Zugabe von 1 g HPMC zu 200 ml H2O und vorsichtigem Mischen, bis es vollständig gelöst war,
hergestellt. Eine 250 Einheit/ml GOX (Typ VII von Aspergillus niger,
Sigma Chemicals) wurde in H2O hergestellt.
Eine 0,1 M Glucose-Lösung wurde
durch Zugabe von 1,8 g D-Glucose (MG = 180) zu 100 ml H2O
hergestellt.
-
Zubereitung
einer einfachen Sterilisatorarbeitslösung:
-
Die obigen Inhaltsstoffe wurden zu
300 ml H2O in der angegebenen Reihenfolge
zugegeben. Jede Materialzugabe wurde vor der nächsten Zugabe vollständig gelöst. Die
Arbeitslösung
und D-Glucose-Lösungen wurden
durch Filtrieren durch ein 0,22 μm
Filter sterilisiert und beide Lösungen
wurden in die anaerobe Kammer gegeben. Als sich die Kammer bei etwa
20 bis 100 ppm O2 stabilisiert hatte, wurden
40 m) 0,1 M D-Glucose zur Arbeitslösung zugegeben, um eine Endkonzentration
von 7 mM (130 mg/dl) zu erreichen.
-
Ungefähr 100 ml der vollständigen einfachen
Sterilisatorlösung
wurden mittels einer mit Zwischenstück angepassten Spritze durch
ein Klappenventil in 45 x 165 mm EP-Sprühsystemkanister (Gesamtkapazität: 140 ml)
eingefüllt.
Die Dosen wurden dann aus der Kammer entfernt, und die äußere Kammer
des Kanisters wurde mit Stickstoff (N2)
unter Druck gesetzt.
-
Zubereitung
einer komplexen Sterilisatorlösung:
-
Die obigen Inhaltsstoffe wurden zu
300 ml H2O in der angegebenen Reihenfolge
zugegeben. Jede Lösungszugabe
wurde vor der nächsten
Zugabe vollständig
gelöst.
Die Arbeitslösung
und D-Glucose-Lösungen wurden
durch Filtrieren durch ein 0,22 μm
Filter sterilisiert, und beide Lösungen
wurden in die anaerobe Kammer gegeben. Als sich die Kammer bei etwa
20 bis 30 ppm O2 stabilisiert hatte, wurden
40 ml 0,1 M D-Glucose zur Arbeitslösung zugegeben, um eine Endkonzentration
von 7 mM (130 mg/dl) zu erreichen.
-
Etwa 100 ml der vollständigen komplexen
Sterilisatorlösung
wurden in jeden EP-Sprühsystemkanister gefüllt, und
die Kanister mit N2 wie oben beschrieben
unter Druck gesetzt.
-
Um die Mikrobiozid-Kapazitäten der
einfachen Sterilisatorlösung
und der komplexen Sterilisatorlösung gegen
Escherichia coli und Aspergillus fumigatus (Sporen) zu testen, wurden
0,4-ml-Aliquoten frisch versprühter
einfacher Sterilisatorlösung
(4 Kanister wurden getestet) und komplexer Sterilisatorlösung (3
Kanister wurden getestet) zu 0,1 ml der Mikroben-Suspensionen in
Gegenwart von Luft zugegeben. A. fumigatus-Platten wurden nach einer
Inkubationszeit von 120 h abgelesen. Die Kanister-Zubereitungen
waren zum Zeitpunkt des Tests 16 Tage alt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 4 angeführt.
Beide sterilisierenden Lösungen
führten
zu einer wirksamen bakteriziden Wirkung. Pilz-Sporizidwirkung war gegeben, jedoch
nach 90 min Einwirkung nicht abgeschlossen.
-
Tabelle
4
Mikrobiozid-Aktivität
der einfachen und komplexen Sterilisatorlösungen unter Lufteinwirkung
-
Die Lagerbeständigkeit der Kanister mit Sterilisatorlösung wurde
getestet, indem die Zubereitungen bei 4 °C, bei Raumtemperatur und bei
40 °C für etwa 1
Monat gealtert wurden und anschließend das oben in Zusammenhang
mit Tabelle 4 beschriebene Verfahren wiederholt wurde. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 5 angeführt.
-
Tabelle
5
Auswirkung von Temperatur auf die Mikrobiozid-Kapazität der Kanister
mit einfacher und komplexer Sterilisatorlösung
-
Wie in Tabelle 5 gezeigt wird, erhielten
sowohl die einfache Sterilisatorlösung als auch die komplexe Sterilisatorlösung nach
ein monatiger Lagerung die volle Wirksamkeit gegen E. coli aufrecht.
Auch eine Fungizid-Aktivität
gegen A. fumigatus konnte nach einmonatiger Lagerung noch beobachtet
werden.
-
Beispiel
4
Zubereitung, Qualitätskontrolle
auf Lumineszenz-Basis und Mikrobiozid-Kapazität einer hochwirksamen, O
2-aktivierten Mikrobiozid-Sporizid-Formulierung
Zubereitung
einer hochwirksamen Arbeitslösung:
-
Die oben beschriebenen Inhaltsstoffe
wurden wie in Beispiel 3 gemischt. Die Arbeitslösung und eine 0,56 M D-Glucose-Lösung wurden
durch Filtrieren durch ein 0,22 μm
Filter sterilisiert, und beide Lösungen wurden
in die anaerobe Kammer gegeben. Die große Größenordnung dieser Herstellung
machte ein Senken und Halten der O2-Konzentration
schwierig. Die minimale erreichte O2-Konzentration
betrug 35 ppm. 125 ml 0,56 M D-Glucose wurden zur Arbeitslösung zugegeben,
um eine Glucose-Endkonzentration von 6,9 nM (130 mg/dl) zu erreichen.
Etwa 100 ml der vollständigen
hochwirksamen Sterilisatorlösung
wurden in jeden EP-Sprühsystemkanister
eingefüllt,
und die Kanister wurden wie in Beispiel 3 beschrieben mit N2 unter Druck gesetzt. 99 Kanister wurden
gefüllt.
-
Die Mikrobiozid-Kapazitäten von
Kanistern, die am Anfang, in der Mitte und am Ende hergestellt worden
waren, wurde mittels dem vorher in Zusammenhang mit den Daten aus
Tabelle 4 beschriebenen Verfahren getestet. Escherichia coli (119.800.000
CFU/ Test) wurden bei sämtlichen
getesteten Sterilisatorkanistern innerhalb von 30 min abgetötet. Obwohl
das Abtöten
von Aspergillus fumigatus-Sporen (2.300.000 CFU/Test) nicht abgeschlossen
war, erreichten die Sterilisatorkanister nach einer Einwirkzeit
von 90 min bei Raumtemperatur eine hundertfache Abtötungsrate.
-
Beispiel 5
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Zubereitung und Testen von O2-aktivierter, desinfizierenden-sterilisierender
Lösungen
mit unterschiedlichen Substrat-Oxidase-Antriebsmitteln Zubereitung
einer desinfizierenden-sterilisierenden Linsenlösung: Zubereitung von Stammlösungen:
Tween 80 und Na2EDTA-Lösungen wurden wie in Beispiel
3 beschrieben hergestellt. Eine 1,0 M Glycinlösung wurde durch Zugabe von
75 g (M. W. 75) zu 1 l H2O zubereitet. Eine
1%ige (Gew./Vol.) Hydroxypropylmethylcellulose-Lösung (HPMC, 100 Centipoise)
wurde durch Zugabe von 5 g HPMC zu 500 ml H2O
und vorsichtiges Mischen, bis diese vollständig gelöst war, hergestellt. Acetatpuffer
(20 mM, pH 6,8) wurde durch Zugabe von 1,2 ml Eisessig (C2H4O2,
MG = 60) und 1,64 g Natriumacetat (NaC2H3O2, MG = 82) pro
Liter H2O hergestellt.
-
Zubereitung
einer normalen Arbeitslösung:
-
Die Inhaltsstoffe wurden wie oben
beschrieben gemischt. Die Arbeitslösung wurde für die Herstellung von
vier unterschiedlichen Substrat-Oxidase-Zubereitungen verwendet.
Die vier getesteten Oxidasen waren: (1) Cholinoxidase, (2) Glycerin-3-phosphat-Oxidase,
(3) Galactose-Oxidase und (4) D-Aminosäure-Oxidase. Die Oxidase-Endaktivität aller
Zubereitungen lag bei 1 Einheit/ml der Endzubereitung. Cholin, Glycerin-3-phosphat,
D-Galactose und
Glycin wurden mit einer Endkonzentration von 2,5 mM als Substrate
für die
Oxidasen eingeschlossen. Die MPO-Konzentration der Zubereitung lag
bei etwa 100 pMol/ml. Die Lösungen
wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert und in
die anaerobe Kammer gegeben. Die erreichte minimale O2-Konzentration
betrug 10 ppm. Nach dem Aufbrauchen des O2 wurden
die Oxidasen und ihre spezifischen Substrate zu den verschiedenen
Zubereitungen in der anaeroben Kammer zugegeben. Etwa 100 ml jeder
vollständigen
Substrat-Oxidase-Sterilisatorlösung
wurde in jeden der EP-Sprühsystemkanister
eingefüllt, und
die Kanister wurden wie in Beispiel 3 beschrieben mit N2 unter
Druck gesetzt.
-
Diese Versuche waren darauf ausgerichtet,
die Möglichkeiten
zu testen, andere Substrat-Oxidase-Kombinationen
als Glucose/Glucose-Oxidase für
die Formulierung von O2-aktivierten desinfizierenden-sterilisierenden
Lösungen
zu verwenden. Anhand des Verfahrens aus Beispiel 3 wurde die antikmikrobielle
Aktivität
jeder Zubereitung gegen E. coli und S. aureus getestet. Die Ergebnisse
der Tests sind in Tabelle 6 angeführt, wobei „Verdünnung" die Verdünnung des Sterilisators angibt;
d. h. das Endverhältnis
von MPO : Oxidase zu Mikroben-Suspension, und 0 steht für kein Wachstum
bei der geringsten Verdünnung,
d. h. weniger als 100 CFU.
-
Tabelle
6
Mikrobiozid-Kapazitäten
verschiedener Substrat-Oxidase-Formulierungen
-
Jede der Substrat-Oxidase-Formulierungen
aus Tabelle 6 wies eine Mikrobiozid-Wirkung auf, doch keine der
getesteten Zubereitungen zeigte einen besonderen Vorteil gegenüber dem
vorher getesteten Glucose/Glucose-Oxidase-System.
-
Beispiel 7
-
Zubereitung und Testen
von O2-aktivierten desinfizierenden-sterilisierenden
Formulierungen für
die ophtalmische Verwendung
-
Zubereitung einer desinfizierenden-sterilisierenden
Linsenlösung:
-
Zubereitung von Stammlösungen:
Die Stammlösungen
entsprachen im Wesentlichen den in Beispiel 6 beschriebenen.
-
Zubereitung
einer desinfizierenden-sterilisierenden Linsenarbeitslösung:
-
Die Inhaltsstoffe wurden wie vorhergehend
beschrieben gemischt, um die Arbeitslösung herzustellen. Die Glucose-Oxidase
vom Typ VII (1.000 Einheiten GOX/ml) wurde zur
Lösung hinzugefügt, um vier
Formulierungen herzustellen:
Formulierung A: 0,5 ml GOX/l Lösung ∴ 0,5 Einheiten/ml
(zuletzt).
Formulierung B: 1 ml GOX/l Lösung ∴ 1 Einheit/ml (zuletzt).
Formulierung
C: 2 ml GOX/l Lösung ∴ 2 Einheiten/ml
(zuletzt).
Formulierung D: 4 ml GOX/l Lösung ∴ 4 Einheiten/ml (zuletzt).
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Die MPO-Konzentration der Zubereitung
(unverdünnt)
betrug etwa 100 pMol/ml. die Lösungen
wurden durch Filtrieren durch ein 0,22 μm Filter sterilisiert und in
die anaerobe Kammer gegeben. Die erreichte minimale O2-Konzentration
war 10 ppm. Nach dem Aufbrauchen des O2 wurden
die Oxidasen und ihre spezifischen Substrate zu den verschiedenen
Zubereitungen in der anaeroben Kammer hinzugefügt. Etwa 100 ml jeder vollständigen desinfizierenden-sterilisierenden
Linsenformulierung wurden in jeden der EP-Sprühsystemkanister eingefüllt, und
die Kanister wurden wie vorhergehend beschrieben mit N2 unter
Druck gesetzt.
-
Diese vier Zubereitungen waren darauf
ausgerichtet und getestet, eine desinfizierendesterilisierende Kontaktlinsenpflegeformulierung
mit hervorragender Mikrobiozid-Sporizid-Kapazität und minimalen Wirtstoxizitätspotential
zu erzeugen. Die Versuche mit diesen Formulierungen waren zudem
so gestaltet, dass Fragen bezüglich
der Aktivitätsdauer
nach dem Einwirken von O2 und der langfristigen
Lagerbeständigkeit
der Kanisterzubereitungen geklärt
werden konnten. Die Mikrobiozid-Sporizid-Aktivitäten der Formulierungen gegen
5. aureus, E. coli und A. fumigatus wurden mittels dem Verfahren
aus Beispiel 3 unmittelbar 2 h und 4 h nach der Lufteinwirkung getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angeführt. Die Formulierungen sind
in die Kanister gefüllt
worden und zum Zeitpunkt der Tests sechs Monate gelagert gewesen.
-
Tabelle
7
Mikrobiozid-Aktivität
in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung bei ophtalmischen
desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen (6 Monate nach
der Herstellung)
-
Vollständige Abtötung der Staphylococcus aureus
und Escherichia coli konnte bei allen Formulierungen zu jeden getesteten
Zeitpunkt nach der O2-Einwirkung beobachtet
werden. Die Abtötung
der Apergillus fumigatus-Sporen unmittelbar nach dem Einwirken von
Luft auf die Formulierungen war proportional zur GOX-Konzentration
der Formulierungen. Die Formulierung A (0,5 Einheiten GOX/ml) wies
nur eine minimale Abtötungsrate
auf. Die Formulierungen B, C und D, deren GOX-Aktivität progressiv
anstieg, zeig ten auch progressiv höhere Abtötungsraten. Die Formulierungen
wiesen 2 h und 4 h nach dem Einwirken von O2 sogar
eine noch besseres Mikrobiozid-Sporizid-Aktivität auf. Die Formulierungen waren
4 h nach dem Einwirken von O2 am wirksamsten.
Um diesen Trend weiter untersuchen zu können, wurde der Versuch erweitert
und Zeitpunkte eingeschlossen, deren zeitlicher Abstand zum Einwirken
von 0 noch größer war,
wobei die Formulierungen verwendet wurden, die für 7 Monate in den Kanistern
gelagert worden waren. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle
8 angeführt.
-
Tabelle
8
Mikrobiozid-Aktivität
in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung bei den ophtalmischen
desinfizierenden-sterilisierenden Formulierungen (7 Monate nach
der Herstellung)
-
-
Die Ergebnisse der Tests, die 4 h
nach der O2-Einwirkung durchgeführt wurden,
stimmten zwischen Anfangsversuch (Tabelle 7) und Folgeversuch (Tabelle
8) im Wesentlichen überein.
Die Mikrobiozid-Sporizid-Aktivitäten
der Formulierungen 8 h nach dem Einwirken von O2 blieben
gleich oder nahmen leicht zu. 12 h und insbesondere 24 h nach der
O2-Einwirkung konnte jedoch eine geringfügige Abnahme
bei der Abtötungsrate
von Staphylococcus aureus und Aspergillus fumigatus beobachtet werden.
-
Wie in der US-A-5.389.369 offenbart
ist, müssen
zum Abtöten
von Pilzsporen MPO: GOX desinfizierende-sterilisierende Lösungen relativ
lange einwirken. Daher wurden die Versuche aus Tabelle 8 mit Einwirkzeiten
von 12 h und 24 h wiederholt, um einen Vergleich zwischen der Bakterizid-Fungizid-Wirkung
nach 1 h und der nach 4 h Einwirkung der desinfizierenden-sterilisierenden
Formulierungen zu ermöglichen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angeführt.
-
Tabelle
9
Mikrobiozid-Wirkung in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung
und des Mikroben-Kontakts bei ophtalmischen desinfizierenden-sterilisierenden
Formulierungen (8 Monate nach der Herstellung)
-
Die Mikrobiozid-Kapazitäten der
Formulierungen, die für
11 Monate in den Kanistern gelagert worden waren, wurden gegen Pseudomonas
aeruginosa und Candida albicans nach O2-Einwirkzeiten
von bis zu 48 h getestet. Die Abtötungskapazität wurde
für Einwirkzeiten
von 1 h sowie 4 h gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angeführt.
-
Tabelle
10
Mikrobiozid-Aktivität
in Bezug auf die Zeitdauer der Lufteinwirkung und des Mikroben-Kontakts
bei desinfizierenden-sferlisierenden Linsenformulierungen (10 Monate
nach der Herstellung)
-
Elf Monate nach der Herstellung töteten alle
Formulierungen Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans nach
einer O2-Einwirkzeit von 24 h oder länger vollständig ab.
-
Zuletzt wurde die Mikrobiozid-Aktivität für verschiedene
Verdünnungen
der Formulierung D (oben beschrieben), die ein Jahr lang in den
Kanistern gelagert worden war, gegen E. coli, P. aeruginosa, C.
albicans und A. fumigatus in Bezug auf Lufteinwirkzeiten von bis
zu 24 h bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angeführt.
-
-
Wie aus Tabelle 11 ersichtlich ist,
war die Formulierung D nach einem vollen Jahr Lagerung immer noch
gegen alle getesteten Organismen hochaktiv.