Elektrophorese. 1. Gelelektrophorese nativ denaturierend. 2. Elektroelution. 3. Western-Blot. 4. Kapillarelektrophorese -37-

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1 Elektrophorese 1. Gelelektrophorese nativ denaturierend 2. Elektroelution 3. Western-Blot 4. Kapillarelektrophorese -37-

2 Elektrophorese - Historie I Arne Tiselius: 30er Jahre des 20. Jahrhunderts Trennung von menschlichem Serum in 4 Komponenten Albumin, Globuline ", $ und ( Nobelpreis: 1948 Weiterentwicklung zur Zonenelektrophorese antikonvektive Träger: Papier, Agargele und Kieselgele sehr diffuse Banden wegen Eigenladung Inerte Matrices: Stärkegele (1955, Smithies) Trennung von DNA-Fragmenten Celluloseacetatfolien (1957, Kohn) Klinische Routineuntersuchungen Polyacrylamidgele (1959, Raymond und Weintraub) Inert, vollständig transparent, höchstes Auflösungsvermögen für DNA-Fragmente, Proteine und Peptide Agarosegele (1961, Hjertén) Trennung von DNA-Fragmenten, Immunelektrophorese Isoelektrische Fokussierung (IEF), 1966 ph-gradient mit Trägerampholyten sehr hoch auflösende Elektrophoresemethode Proteine wandern in einem ph-gradienten bis zu dem ph- Wert, der ihrem isoelektrischen Punkt (pi) entspricht seit 1982 immobilisierte ph-gradienten -38-

3 Elektrophorese - Historie II SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat), 1967 Denaturierung von Proteinen Molekulargewichtsbestimmung (SDS-PAGE) Gradientengele, 1967, Margolis und Kenrick Zweidimensionale Elektrophorese (2-DE), 1975 Erste Dimension: IEF Zweite Dimension: SDS-PAGE seit DE mit immobilisierten ph-gradienten Auflösung: mehrere Tausend Proteine auf 20 cm x 20 cm Blotting-Techniken, 1975 Southern-Blot (DNA-Fragmente aus Agarose-Gelen) Northern-Blot (RNA-Fragmente) Western-Blot (Proteine) Kapillarelektrophorese,

4 Theoretische Grundlagen I Definition Die elektrophoretische Beweglichkeit (Mobilität) ist eine substanzspezifische Größe, die die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld bestimmt und damit für die Trennung entscheidend ist. Kraft im elektrischen Feld F e = qce mit q = zce Reibungskraft F r = f c Cv q: Ladung z: Ladungszahl e: Elementarladung in Coulomb E: elektrische Feldstärke v: Wanderungsgeschwindigkeit f c : Reibungskoeffizient Gleichgewicht beider Kräfte: K konstante Wanderungsgeschwindigkeit F e = F r qe = f c Cv u: Mobilität -40-

5 Theoretische Grundlagen I Mobilität u für kugelförmige Moleküle (Stokessche Gesetz) 0: Viskosität der Lösung r: Radius des hydratisierten Ions für nicht-kugelförmige Moleküle empirischer M: Molekulargewicht Zusammenhang: d: 1/3 bis 2/3 Joulesche Wärme c: molare Konzentration des Analyten E: elektrische Feldstärke 8: Äquivalenzleitfähigkeit K Puffer erwärmt sich ungleichmäßig K Konvektion wirkt Trennung entgegen K Inerte Matrix einsetzen -41-

6 Agarose-Gele Relativ großporig: nm (1-0,16 Gew.%) Polysaccharid (aus Rotalge) Charakterisierung über Schmelzpunkt Herstellung: Erhitzen, auf Platte gießen, geliert beim Abkühlen Struktur Polyacrylamid-Gele chemisch inert stabil klares Gel Porengröße über Totalacrylamid- (T) und Vernetzungsgrad (C) definiert -42-

7 Apparaturen Vertikale Elektrophoreseapparatur Horizontale Gelelektrophorese -43-

8 Färbetechniken 1. Organische Farbstoffe z.b. Coomassie Brillant Blau (Triphenylmethanfarbstoff) Gel mit Farbstoff färben Farbstoff bindet an Proteine (ionisch und/oder hydrophob) Farbstoff aus Gel herauslösen Proteinbanden sichtbar Nachweisgrenze: bis 100 ng Protein/Bande 2. Silberfärbung Silberionen (AgNO 3 ) binden an Proteine Bildung von Silberkeimen nach der Reduktion Reduktion aller Silberionen im Gel zu metallischem Silber (ähnlich Fotoentwicklung) Reduktion verläuft an Silberkeimen am schnellsten K Proteinbanden sichtbar (schwarz/braune Bande) sensitiver als Coomassie (<10 ng Protein/Bande) 3. Fluoreszenzfarbstoffe Fluorophore, Metallchelate (z.b. SyproRuby) binden an Proteine (s. Organische Farbstoffe) sehr empfindlich (10 ng), großer dynamischer Bereich Varianten Proteine vor der Elektrophorese kovalent modifizieren 3.1 Saturation Labeling Fluorophor an Cys koppeln (quantitativ) z.b. Cyaninfarbstoffe (Cy3, Cy5) 3.2 Minimal Labeling Fluorophor an Lys koppen (ca. 1% der Aminogruppen) z.b. Cyaninfarbstoffe (Cy3, Cy5) Proteingemische können parallel separat und unabhängig detektiert werden -44-

9 Native Gelelektrophorese Ohne Zusatz von Detergenzien Neutrale bzw. schwach saure/basische Bedingungen Proteine wandern auf Grund der Eigenladung ph-wert! Struktur bleibt erhalten Reibungskraft von Struktur abhängig! Unterschiedliche Puffersysteme einsetzbar Blaue Nativ-PAGE Anionischer Farbstoff (Coomassie Brillant Blau) in Gelmatrix vorlegen Proteine auftragen (z.b. Membranproteine) Coomassie bindet an hydrophobe Bereiche der Proteine Negativ geladener Protein/Coomassie-Komplex wandert durch Gel Protein wird als blaue Bande sichtbar -45-

10 Denaturierende Gelelektrophorese SDS-PAGE Proteine in SDS-haltigem Puffer lösen Negativ geladener Protein/SDS-Komplex Alle Proteine negativ geladen, wandern zur Anode Konstantes Protein/SDS-Verhältnis Wanderungsgeschwindigkeit von Größe abhängig häufigste Technik im Bereich der Proteinanalytik sehr einfach, gute Auflösung, hohe Reproduzierbarkeit Isoelektrische Fokussierung Proteine in einem ph-gradienten trennen (z.b. 3-10) Zusatz von Harnstoff (6 M) Wandern gemäß Eigenladung zum isoelektrischen Punkt und werden dort als scharfe Bande fokussiert (Proteine sind am pi ungeladen) Meist immobilisierte ph-gradienten, kommerziell verfügbar, gut reproduzierbar -46-

11 Zweidimensionale Techniken verschiedene Kombinationen möglich (orthogonal) meist: IEF/SDS-PAGE Auflösung: Proteine Problem: Reproduzierbarkeit, Gel-Gel-Variabilität Standardmethode der Proteomanalytik (Proteomics) -47-

12 Elektroelution Proteinbanden (-spots) aus Gel ausschneiden Gelstücke auf eine Membran legen Spannung anlegen Proteine wandern im elektrischen Feld aus dem Gel Proteine werden oberhalb der Membran angereichert Puffer mit Proteinen abziehen Weitere Aufarbeitung in Lösung Nur für größere Proteinmengen einsetzbar -48-

13 Elektroblotting Proteine: Western-Blot Alle Proteine eines Gels auf eine Membran übertragen Spannung senkrecht zum Gel anlegen Tank- oder Semidry-Blotting Nahezu quantitativer Transfer in einer Richtung (SDS!) Blotzeiten von Proteingröße abhängig Hydrophobe Bindung an Membran (PVDF, Nitrocellulose) SDS wandert weiter, Proteine bleiben an Membran haften Verschiedene Techniken möglich: Edman-Sequenzierung der Proteine Immun-Blot (Proteine mit Antikörper identifizieren) Lektin-Blot (Nachweis von Glykosylierungen) -49-

14 Beispiele: 2-DE und Immunoblot IEF/SDS-PAGE eines E. coli Aufschlusses Immunoblot: Anti-Tau mak, Hirnhomogenat -50-

15 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Prinzip in Kapillare fast keine Konvektion (K keine Matrix) homogener Puffer konstanter ph-wert konstanter Stromfluss einheitliche Feldstärke -51-

16 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Kapillarinnenwand ist negativ geladen (Silanolgruppen) Gegenionen in der Lösung wandern im elektrischen Feld KTransport des Puffers zur Kathode EOF ist vom ph-wert abhängig effektive Kühlung notwendig Resultierendes Flussprofil -52-

17 Beispiel einer CZE Elektropherogramm CZE eines tryptischen Verdaus von Fetuin -53-

18 Trennung von Phosphopeptiden mittels CZE A1: unphosphorylierte Sequenz A2-A4: homologe einfach phosphorylierte Sequenzen (Stellungsisomere!) 50 A1 A2 A4 A3 15% HCOOH 40 Absorption [mau] A1 A1 12,5% HCOOH 10% HCOOH A1 7,5% HCOOH 10 A1 A2, A3, A4 5% HCOOH Zeit [min] -54-