DE10333675A1

DE10333675A1 - Perfusion method for the production of erythropoietin

Info

Publication number: DE10333675A1
Application number: DE2003133675
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. Staerk; Klaus Dr. Scharfenberg; Norbert Dr. Schulze; Kathrin Baumeister; Wilhelm Beltz
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2003-07-24
Publication date: 2005-03-03
Also published as: WO2005012345A8; WO2005012345A1; EP1651669A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Medium adaptiert, die erhaltenen Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium weiter expandiert werden, und bei ständigem Bleeding und ständiger Perfusion das exprimierte EPO aus dem größeren Bioreaktor isoliert und gereinigt wird.The invention relates to a process for the production of erythropoietin (EPO) in which eukaryotic cells suitable for the expression of EPO are adapted to SMIF7 medium in a suitable bioreactor, the resulting cells are transferred to a larger bioreactor and incubated with SMIF7. Medium continue to be expanded, and with constant bleeding and continuous perfusion, the expressed EPO from the larger bioreactor is isolated and purified.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Medium adaptiert, die erhaltenen Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium weiter expandiert werden, und ein „steady state" – Zustand hinsichtlich Zellkonzentration durch kontinuierliche Perfusion und Zellbleeding Strategie realisiert wird.The The invention relates to a method for producing erythropoietin (EPO), in which eukaryotic cells responsible for the expression of EPO are adapted to SMIF7 medium in a suitable bioreactor, transferred the cells obtained in a larger bioreactor and be further expanded with SMIF7 medium, and a "steady state "state in terms of cell concentration through continuous perfusion and Zellbleeding strategy is realized.

Humanes Erythropoietin (EPO) besteht aus 165 Aminosäuren und hat aufgrund der Heterogenität der Glycanstrukturen eine apparente Masse von 34-39 kDa. Das Protein weist drei N-Glycosylierungsstellen an Asn24, Asn38 und Asn83 sowie eine O-Glycosylierungsstelle an Ser126 auf, die zu einem hohen Grad sialyliert sind. Die Bedeutung der Sialylierung für die in vivo Aktivität von EPO ist seit langem bekannt und durch vielen Arbeiten belegt. Schon Lowy et al. (1960, Nature 185: 102-103) konnten zeigen, daß die Desialylierung von EPO zu einem vollkommenen Verlust der in vivo Aktivität führt. Spivak und Hogans ermittelten 1989 (Blood 73: 90-99) eine Halbwertszeit für ein hoch sialyliertes EPO von 53 Minuten. Zum Vergleich zeigte die desialylierte Form lediglich eine Halbwertszeit von 3 Minuten.human Erythropoietin (EPO) consists of 165 amino acids and has due to the heterogeneity of the glycan structures an apparent mass of 34-39 kDa. The protein has three N-glycosylation sites to Asn24, Asn38 and Asn83 as well as an O-glycosylation site Serals that are sialylated to a high degree. The meaning the sialylation for the in vivo activity from EPO has long been known and documented by many works. Lowy et al. (1960, Nature 185: 102-103) were able to show that the desialylation of EPO leads to a complete loss of in vivo activity. Spivak and Hogans found a high half-life in 1989 (Blood 73: 90-99) sialylated EPO of 53 minutes. For comparison, the desialylated showed Form only a half-life of 3 minutes.

Für die großtechnische Produktion bzw. für die Etablierung eines Produktionsprozesses für EPO ergibt sich damit die Forderung durch Auswahl geeigneter Parameter einen möglichst hohen Sialylierungsgrad von EPO zu erreichen. Das vorliegende Verfahren bezieht sich auf die Produktion von EPO auf Basis einer Perfusions/Bleeding Strategie mit einer Cross Flow Filtration als Zellrückhaltung.For the large-scale Production or for the establishment of a production process for EPO thus results in the Demand by selecting suitable parameters as possible high degree of sialylation of EPO to achieve. The present method refers to the production of EPO based on perfusion / bleeding Strategy with a cross flow filtration as cell retention.

Pertusionsverfahren für die großtechnische Expression von rekombinanten Proteinen sind seit langem etabliert und in einer Vielzahl von Publikationen beschrieben.Pertusionsverfahren for the large-scale Expression of recombinant proteins has long been established and described in a variety of publications.

Der Nutzen derartiger Herstellungsverfahren besteht generell in sehr hohen Raum/Zeitausbeuten im Vergleich zu anderen Prozessführungsstrategien (Batch, Fed-Batch). Hierbei werden z.B. die Aufkonzentrierung von toxischen Metaboliten und Substratlimitierungen verhindert, wodurch höhere Zelldichten und höhere Vitalitäten erreicht werden, was letztendlich längere Produktionszeiten und d.h. Raum/Zeitausbeuten gewährleistet.Of the Benefits of such manufacturing processes are generally very high high space / time yields compared to other process management strategies (Batch, fed-batch). Here, e.g. the concentration of preventing toxic metabolites and substrate limitations higher Cell densities and higher vitality achieved which will ultimately be longer Production times and i. Space / time yields ensured.

Die Nutzung einer solchen Herstellungsstrategie für die Produktion eines Glycoproteins, z.B. EPO, ist besonders vorteilhaft, da das Produkt kontinuierlich dem Prozess entzogen wird, wodurch Degradationen durch Glycosidasen und Proteasen etc. minimiert werden können. Aus den oben genannten Gründen ergibt sich, dass ein solches Herstellungsverfahren den für EPO erforderlichen hohen Sialylierunggrad gewährleisten sollte.The Use of such a production strategy for the production of a glycoprotein, e.g. EPO, is particularly advantageous because the product is continuous deprived of the process, causing degradation by glycosidases and proteases, etc. can be minimized. From the above establish it follows that such a manufacturing process is necessary for EPO should ensure high degree of sialylation.

Als Zellrückhaltesysteme für die Realisierung solcher Strategien sind in Abhängigkeit von der verwendeten Zellinie und den speziellen Anforderungen Cross-flow Filter (Prostak), Spinfilter, Ultraschallseperatoren, Zentrifugen und Inclined Settler in der Anwendung (Woodside et al. 1998, Mammalina cell retention devices for stirred perfusion bioreactors, Cytotechnology 28: 163-175; Castilho, L.R., Medronho, R.A. 2002, Cell retention devices for suspended-cell perfusion cultures, Adv Biochem Eng Biotechnol. 74: 129-169). Das in dem hier vorliegenden Produktionsverfahren zur Zellrückhaltung zum Einsatz gekommene Prostakmodul, das auf einer Cross Flow Filtration (Tangential Flow Filtration) beruht, ist ebenfalls in der Literatur gut dokumentiert. So sind mit der hier verwendeten Cross Flow Filtration verschiedene Hybidomazellen und Krebszellen kultiviert worden (z.B. Kawahara et al. 1994, Cytotechnology 14: 61; de la Broise et al. 1992, Biotechnol Bioeng 40: 25). Obwohl Prostakmodule käuflich erhältlich sind, ist die Verwendung im Pilotmaßstab in der Literatur wenig dokumentiert.When Cell retention systems for the Realization of such strategies are dependent on the used Cell line and the special requirements of cross-flow filter (Prostak), Spin Filters, Ultrasonic Separators, Centrifuges and Inclined Settlers in use (Woodside et al., 1998, Mammalina cell retention devices for stirred perfusion bioreactors, Cytotechnology 28: 163-175; Castilho, L.R., Medronho, R.A. 2002, Cell retention devices for suspended-cell perfusion cultures, Adv Biochem Eng Biotechnol. 74: 129-169). The present in the present production method for Cell retention used Prostakmodul on a cross flow filtration (Tangential Flow Filtration) is also in the literature well documented. So are with the Cross Flow Filtration used here various Hybidomacells and cancer cells have been cultured (e.g. Kawahara et al. 1994, Cytotechnology 14: 61; de la Broise et al. 1992, Biotechnol Bioeng 40:25). Although Prostak modules are available for purchase, is the pilot scale use Little documented in the literature.

Im folgenden wird eine auf die GA-EPO HT1080 Zelle (Herstellung detailiert beschrieben in „Trial Exhibit No. 20, Amgen Inc. V. Hoechst Marion Roussel, Inc. and Transkaryotic Therapies, Inc; US District Court of Massachusetts C.A. 97-10814WGY") adaptierte Perfusions/Bleedingstrategie mit Cross Flow Filtration bis in den 100 L Maßstab beschrieben, die einen robusten Kultivierungsprozeß von bis zu 32 Produktionstagen gewährleistet. Die Zellrückhaltung wird dabei über ein Prostakmodul mit drei hintereinandergeschalteten 10 stacks (Millipore, Molsheim, Frankreich) realisiert. Die maximale tägliche volumetrische Kapazität der 100 L Perfusionsanlage beträgt mit diesem Setup 2,5 Reaktorvolumina entsprechend 250 L d^–1.The following is a detail of the GA-EPO HT1080 cell (manufactured in detail described in "Trial Exhibit No. 20, Amgen Inc. V. Hoechst Marion Roussel, Inc. and Transkaryotic Therapies, Inc., US District Court of Massachusetts CA 97-10814WGY"). ) adapted perfusion / bleeding strategy with cross flow filtration up to the 100 L scale, which guarantees a robust cultivation process of up to 32 production days.The cell retention is realized via a Prostak module with three successive 10 stacks (Millipore, Molsheim, France) maximum daily volumetric capacity of the 100 L perfusion unit is 2.5 reactor volumes corresponding to 250 L d ^-1 with this setup.

Wie sich bei der Entwicklung zeigte, ist es sehr schwierig, einen kontinuierlichen Perfusionsprozeß unter voller Ausnutzung dieser Systemparameter zu etablieren, da bei auftretenden Problemen, wie z.B. der Akkumulation von toxischen Metaboliten, kein Handlungsspielraum besteht (z.B. durch Erhöhung der Perfusionsrate). Des weiteren besteht die Gefahr, daß die Filter der Prostak-Module bedingt durch höhere Zelldichten schneller blockieren, was letztendlich zu einem schnelleren Prozeßabbruch führt.As showed itself in the development, it is very difficult to have a continuous Perfusion process under full use of these system parameters to establish, as occurring Problems, such as the accumulation of toxic metabolites, there is no room for maneuver (e.g., by increasing the rate of perfusion). Of further there is a risk that the Filter of Prostak modules due to higher cell densities faster block, which ultimately leads to a faster process termination leads.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass kontinuierlich hohe Ausbeuten von EPO mit einer Perfusions-/Bleedingstrategie erhalten werden, bei der das Setup nur eine niedrigere Auslastung hat und vorzugsweise spezielle Kulturmedien zum Kultivieren der Zellen benutzt werden. Das hier dargelegte Verfahren beschreibt eine Perfusions/Bleedingstrategie, bei der in der Produktionsphase eine Zelldichte von ungefähr 1-3 E⁶ ml^–1 konstant gehalten wird. Diese Verfahrensweise beinhaltet unter den gewählten Bedingungen eine etwa 50 %-ige Auslastung entsprechend etwa 125 L d^–1 Perfundat.It has now surprisingly been found that continuously high yields of EPO are obtained with a perfusion / bleeding strategy in which the setup has only a lower utilization and preferably special culture media are used to cultivate the cells. The method described here describes a perfusion / bleeding strategy in which a cell density of approximately 1-3 E ⁶ ml ^{-1 is} kept constant in the production phase. This procedure involves about 50% utilization corresponding to about 125 L d ^-1 perfundate under the conditions chosen.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem

(a) eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Medium adaptiert und bis zu einer solchen Zelldichte expandiert werden, so daß im nachfolgenden Schritt (b) eine Zelldichte von 2 × 10⁵ ml^–1 bis 5 × 10⁵ ml^–1 erhalten wird,
(b) die in Schritt (a) erhaltenen Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium kultiviert,
(c) die in dem größeren Bioreaktor kultivierten Zellen bis zu einer Zelldichte von 1 × 10⁶ ml^–1 bis 1 × 10⁷ ml^–1 expandiert werden,
(d) durch eine Perfusions/Bleedingstrategie eine Zelldichte von 1 × 10⁶ ml^–1 bis 1 × 10⁷ ml^–1 konstant gehalten wird (steady state) und das exprimierte EPO aus dem größeren Bioreaktor kontinuierlich entfernt, isoliert und gereinigt wird,

wobei vorzugsweise die zunächst in gefrorener Form vorliegenden eukaryontischen Zellen mit dem Medium DMEM/F12 1:1 revitalisiert werden, und vorzugsweise wie ebenfalls dem SMIF7-Medium pro Liter mit 1,5 bis 2,5 g NaHCO₃, besonders bevorzugt 2,0 bis 2,3 g, ganz besonders bevorzugt 2,16 g NaHCO₃; 0,2 bis 5 g, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 g, ganz besonders bevorzugt 1 g BSA; 0,2 bis 5 mg, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 mg, ganz besonders bevorzugt 1 mg humanem Transferrin; 1 bis 30 mg, besonders bevorzugt 5 bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt 10 mg humanem Insulin; 1 bis 3 mg, besonders bevorzugt 2 mg Hydrocortison; 0,01 bis 0,1 mg, besonders bevorzugt 0,025 bis 0,045 mg, ganz besonders bevorzugt 0,039 mg Dexamethason; 0,08 bis 3 mg, besonders bevorzugt 1,5 bis 3 mg, ganz besonders bevorzugt 2 mg Putrescin, 40 bis 100 mg, besonders bevorzugt 50 bis 80 mg, ganz besonders bevorzugt 60 mg Ethanolamin; 200 bis 500 mg, besonders bevorzugt 250 bis 400 mg, ganz besonders bevorzugt 292 mg Glutamin und 50 bis 100 mg, besonders bevorzugt 70 bis 90 mg, ganz besonders bevorzugt 80 mg Serin, supplementiert werden.An object of the invention is a process for the production of erythropoietin (EPO) in which

(a) eukaryotic cells suitable for expression of EPO are adapted to SMIF7 medium in a suitable bioreactor and expanded to such a cell density that in subsequent step (b) a cell density of 2 x 10 ⁵ ml ^-1 until 5 × 10 ⁵ ml ^{-1 is} obtained,
(b) transferring the cells obtained in step (a) to a larger bioreactor and cultivating with SMIF7 medium,
(c) the cells cultured in the larger bioreactor are expanded to a cell density of 1 × 10 ⁶ ml ^-1 to 1 × 10 ⁷ ml ^-1
(d) a cell density of 1 × 10 ⁶ ml ^-1 to 1 × 10 ⁷ ml ^{-1 is} kept constant by a perfusion / bleeding strategy (steady state) and the expressed EPO is continuously removed from the larger bioreactor, isolated and purified,

preferably wherein the eukaryotic cells initially present in frozen form are revitalized with the medium DMEM / F12 1: 1, and preferably as well as the SMIF7 medium per liter with 1.5 to 2.5 g NaHCO ₃ , more preferably 2.0 to 2.3 g, most preferably 2.16 g NaHCO ₃ ; 0.2 to 5 g, more preferably 0.5 to 2 g, most preferably 1 g of BSA; 0.2 to 5 mg, more preferably 0.5 to 2 mg, most preferably 1 mg of human transferrin; 1 to 30 mg, more preferably 5 to 15 mg, most preferably 10 mg of human insulin; 1 to 3 mg, more preferably 2 mg hydrocortisone; 0.01 to 0.1 mg, more preferably 0.025 to 0.045 mg, most preferably 0.039 mg of dexamethasone; 0.08 to 3 mg, more preferably 1.5 to 3 mg, most preferably 2 mg of putrescine, 40 to 100 mg, more preferably 50 to 80 mg, most preferably 60 mg of ethanolamine; 200 to 500 mg, more preferably 250 to 400 mg, most preferably 292 mg glutamine and 50 to 100 mg, more preferably 70 to 90 mg, most preferably 80 mg serine, are supplemented.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei der Bioreaktor aus Schritt (a) ein Volumen von 5 bis 50 Litern hat, und/oder der größere Bioreaktor aus Schritt (b) ein Volumen von 50 bis 200 Litern hat.One Another object of the invention is a method as described above, wherein the bioreactor of step (a) has a volume of 5 to 50 liters has, and / or the larger bioreactor from step (b) has a volume of 50 to 200 liters.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei die eukaryontischen Zellen in Schritt (a) und/oder Schritt (c) bis zu einer Zelldichte von 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁷ ml^–1 , vorzugsweise von 1 × 10⁶ bis 3 × 10⁶ ml^–1 expandiert werden, und vorzugsweise die eukaryontischen Zellen GA-EPO HT 1080 – Zellen sind.Another object of the invention is a method as described above, wherein the eukaryotic cells in step (a) and / or step (c) up to a cell density of 1 × 10 ⁶ to 1 × 10 ⁷ ml ^-1 , preferably 1 × 10 ⁶ to 3 × 10 ⁶ ml ^-1 , and preferably the eukaryotic cells are GA-EPO HT 1080 cells.

Im folgenden werden die Erfindungsgegenstände anhand eines Beispiels näher erkäutert, ohne sich darauf zu beschränken.in the The following are the subjects of the invention by way of example further explained, without to limit yourself to it.

Beispiel: Kultivierung einer EPO produzierenden ZellinieExample: cultivation an EPO producing cell line

Die aus einer Cryozellbank revitalisierten GA-EPO HT 1080 Zellen werden in DMEM/F12 1:1 (Invitrogen), das pro Liter mit 2,16 g NaHCO₃ (Merck), 1 g BSA (Sigma), 1 mg humanen Transferrin (Chiron), 10 mg humanen rekombinanten Insulin (Aventis), 2 mg Hydrocortison (Sigma), 0,039 mg Dexamethason (Sigma), 2 mg Putrescin (Sigma), 60 mg Ethanolamin (Sigma), 1 g Pluronic F68 (Sigma), 292 mg Glutamin (Fluka) und 80 mg Serin (Fluka) supplementiert wurde in T-Flaschen und Spinnern expandiert und in einen 20L Bioreaktor inokuliert. In diesem werden die Zellen auf SMIF7 Medium (Invitrogen) umadaptiert, das analog zu DMEM F12 1:1 mit den gleichen Chemikalien und Mengen supplementiert wurde. Nach einer Adaptationszeit von ca. 14 Tagen erfolgt der Transfer der Zellen in den 100L Bioreaktor bei einer Zelldichte von 3 × E⁵ ml^–1. Die minimalen Produktionsparameter (Zelldichte größer gleich 1E⁶ ml^–1 werden nach ca. 9 Tagen erreicht (Tab. 1, Beginn der Produktionsphase).The GA-EPO HT 1080 cells revitalized from a cryo-cell bank are incubated in DMEM / F12 1: 1 (Invitrogen) per liter with 2.16 g NaHCO ₃ (Merck), 1 g BSA (Sigma), 1 mg human transferrin (Chiron ), 10 mg human recombinant insulin (Aventis), 2 mg hydrocortisone (Sigma), 0.039 mg dexamethasone (Sigma), 2 mg putrescine (Sigma), 60 mg ethanolamine (Sigma), 1 g Pluronic F68 (Sigma), 292 mg glutamine (Fluka) and 80 mg serine (Fluka) were supplemented in T-bottles and spinners and expanded into a 20L bioreactor inoculated. In this, the cells are re-adapted to SMIF7 medium (Invitrogen), which was supplemented analogously to DMEM F12 1: 1 with the same chemicals and amounts. After an adaptation time of about 14 days, the cells are transferred to the 100 L bioreactor at a cell density of 3 × E ⁵ ml ^-1 . The minimum production parameters (cell density greater than or equal to 1E ⁶ ml ^-1 are reached after about 9 days (Table 1, beginning of the production phase).

Tab. 1: Kultivierung von GA-EPO Zellen mit einer Perfusions/Bleedingstrategie.

Tab. 1: Cultivation of GA-EPO cells with a perfusion / bleeding strategy.

Die stabile Produktionsphase beträgt 32 Tage. Dabei werden 4530 L Kulturüberstand erzeugt, die 46,64 g EPO enthalten (c_EPO zwischen 6,3-17,7 mg ml^–1). Die Beurteilung der Qualität von EPO erfolgt über Analyse der Z-Zahl. Durch HPAE Chromatographie (high-pH anion-exchange chromatography) werden dabei die N-Glycane aufgrund ihrer Ladung (non sialo, mono sialo etc.) getrennt. Zur Berechnung der Z-Zahl werden die jeweiligen Peakflächen mit ihrer korrespondierenden Ladung multipliziert und die Einzelergebnisse aufsummiert. Die Z-Zahl liefert dadurch wichtige Erkenntnisse hinsichtlich des Sialylierungstatus und der Antennärität von N-Glycanen. Hochgereinigte Therapeutika von rhu EPO der Firmen Roche Mannheim, Amgen, Organon Teknika und Merckle besitzen Z-Zahlen von 361, 367, 286 bzw. 323 (Hermentin et al., (1996), The hypothetical N-glycan charge: a number that characterizes protein glycosylation, Glycobiology 6: 217-230). Das hier dargelegte Perfusionsverfahren liefert über den gesamten Prozeß Z-Zahlen des kruden, nicht aufgereinigten EPO zwischen 278 und 337 (Mittelwert 315,5). Für ein nicht aufgereinigtes EPO ist das ein hoher Wert und zeigt damit die Machbarkeit der dargelegten Perfusions/Bleedingstrategie.The stable production phase is 32 days. This produces 4530 L of culture supernatant containing 46.64 g of EPO (c _EPO between 6.3-17.7 mg ml ^-1 ). The quality of EPO is assessed by analyzing the Z-number. By HPAE chromatography (high-pH anion-exchange chromatography) while the N-glycans are separated due to their charge (non sialo, mono sialo, etc.). To calculate the Z-number, the respective peak areas are multiplied by their corresponding charge and the individual results are added up. The Z number thus provides important insights into the sialylation status and the antennality of N-glycans. Highly purified therapeutics of rhu EPO from Roche Mannheim, Amgen, Organon Teknika and Merckle have Z numbers of 361, 367, 286 and 323, respectively (Hermentin et al., (1996), The hypothetical N-glycan batch: a number that characterizes protein glycosylation, Glycobiology 6: 217-230). The perfusion method presented here yields Z-numbers of the crude, unpurified EPO between 278 and 337 (mean 315.5) throughout the process. For a non-purified EPO this is a high value and thus demonstrates the feasibility of the presented perfusion / bleeding strategy.

Claims

Process for the preparation of erythropoietin (EPO) in which a. eukaryotic cells that are suitable for expression of EPO in a suitable bioreactor adapted to SMIF7 medium and grown to a cell density of 5 x 10 ⁵ to 5 x 10 ⁶ ml ^-1 are expanded, b. the cells obtained in step (a) are transferred to a larger bioreactor and incubated with SMIF7 medium up to ei a cell density of 1 × 10 ⁵ ml ^-1 to 1 × 10 ⁶ ml-1, c. the cells cultured in the larger bioreactor are expanded to a cell density of 5x10 ⁵ to 5x10 ⁶ ml ^-1 , i. with constant bleeding and continuous perfusion, the expressed EPO is isolated and purified from the larger bioreactor.

Method according to claim 1, the first eukaryotic cells present in frozen form with the medium DMEM / F12 be revitalized 1: 1.

A method according to claim 2, wherein said for revitalization and the SMIF7 medium per liter with 1.5 to 2.5 g of NaHCO ₃ ; 0.2 to 5 g of BSA; 0.2 to 5 mg of human transferrin; 1 to 30 mg of human insulin; 1 to 3 mg hydrocortisone; 0.01 to 0.1 mg dexamethasone; 0.08 to 3 mg of putrescine, 40 to 100 mg of ethanolamine; 200 to 500 mg glutamine and 50 to 100 mg serine is supplemented.

A process according to claim 2, wherein the revitalization and SMIF7 medium per liter is 2.0 to 2.3 g NaHCO ₃ ; 0.5 to 2 g of BSA; 0.5 to 2 mg of human transferrin; 5 to 15 mg of human insulin; 1 to 3 mg hydrocortisone; 0.025 to 0.045 mg of dexamethasone; 1.5 to 3 mg putrescine, 50 to 80 mg ethanolamine; 250 to 400 mg glutamine and 70 to 90 mg serine is supplemented.

The method of claim 2, wherein the revitalization and the SMIF7 medium per liter with 2.16 g NaHCO ₃ ; 1 g BSA; 1 mg of human transferrin; 10 mg of human insulin; 2 mg hydrocortisone; 0.039 mg dexamethasone; 2 mg putrescine, 60 mg ethanolamine; 292 mg glutamine and 80 mg serine is supplemented.

Method according to one of the preceding claims, wherein the bioreactor from step (a) has a volume of 5 to 50 liters.

Method according to one of the preceding claims, wherein the larger bioreactor from step (b) has a volume of 70 to 200 liters.

Method according to one of the preceding claims, wherein the eukaryotic cells in step (a) and / or step (c) up to a cell density of 8 × 10 ⁵ to 2 × 10 ⁶ ml ^-1 , preferably 1 × 10 ⁶ ml ^-1 to be expanded.

Method according to one of the preceding claims, wherein the eukaryotic cells are GA-EPO HT 1080 cells. Pertusionsverfahren for the Production of erythropoietin