Summary
Het huidige protocol biedt een efficiënte en flexibele methode om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van gekweekte cellen en vervolgens te valideren met behulp van qPCR. Dit dient effectief als vervanging voor andere RNA-voorbereidingskits.
Abstract
De scheiding van intracellulaire componenten is al vele jaren een belangrijk hulpmiddel in de cellulaire biologie en heeft nuttig inzicht kunnen geven in hoe hun locatie hun functie kan beïnvloeden. In het bijzonder is de scheiding van nucleair en cytoplasmatisch RNA belangrijk geworden in de context van kankercellen en de zoektocht naar nieuwe doelen voor geneesmiddelen. Het kopen van kits voor nucleair-cytoplasmatische RNA-extractie kan duur zijn wanneer veel van de vereiste materialen te vinden zijn in een typische laboratoriumomgeving. Met behulp van de huidige methode, die duurdere kits of andere tijdrovende processen kan vervangen, zijn alleen een zelfgemaakte lysisbuffer, een benchtopcentrifuge en RNA-isolatiezuiveringskolommen nodig om nucleair en cytoplasmatisch RNA te isoleren. Lysisbuffer wordt gebruikt om het buitenmembraan van de cel zachtjes te lyseren zonder de integriteit van de nucleaire envelop aan te tasten, waardoor de intracellulaire componenten kunnen worden vrijgegeven. Vervolgens kunnen de kernen worden geïsoleerd door een eenvoudige centrifugatiestap, omdat ze een hogere dichtheid hebben dan de lysisoplossing. Centrifugatie wordt gebruikt om deze gebieden te scheiden op basis van hun dichtheidsverschillen om subcellulaire elementen in de kern te isoleren van die in het cytoplasma. Zodra de centrifugatie de verschillende componenten heeft geïsoleerd, wordt een RNA-opruimkit gebruikt om het RNA-gehalte te zuiveren en wordt qPCR uitgevoerd om de scheidingskwaliteit te valideren, gekwantificeerd door de hoeveelheid nucleair en cytoplasmatisch RNA in de verschillende fracties. Statistisch significante niveaus van scheiding werden bereikt, wat de effectiviteit van het protocol illustreert. Bovendien kan dit systeem worden aangepast voor de isolatie van verschillende soorten RNA (totaal, klein RNA, enz.), Wat gerichte bestudering van cytoplasma-nucleusinteracties mogelijk maakt en helpt bij het begrijpen van de verschillen in de functie van RNA die zich in de kern en het cytoplasma bevinden.
Introduction
Cellulaire fractionering in subcellulaire componenten maakt de isolatie en studie van gedefinieerde biochemische domeinen mogelijk en helpt bij het bepalen van de lokalisatie van specifieke cellulaire processen en hoe dit hun functie kan beïnvloeden1. Isolatie van RNA van verschillende intracellulaire locaties kan zorgen voor een verbeterde nauwkeurigheid van genetische en biochemische analyse van transcriptieniveaugebeurtenissen en andere interacties tussen de kern en het cytoplasma, wat dient als het primaire doel van het huidige protocol2. Dit protocol is ontwikkeld om de isolatie van cytoplasmatische en nucleaire RNA's te garanderen om hun respectieve rollen in nucleaire export te bepalen en om te begrijpen hoe de subcellulaire lokalisatie van RNA's in de kern en het cytoplasma hun functie in cellulaire processen kan beïnvloeden. Met behulp van materialen uit een typische laboratoriumomgeving was het mogelijk om nucleaire en cytoplasmatische fractionering effectiever en goedkoper te bereiken dan eerder vastgestelde protocollen zonder de kwaliteit van de resultaten in gevaar te brengen3.
Bovendien kan de uitwisseling van moleculen tussen het cytoplasma en de kern direct worden bestudeerd door deze regio's te scheiden. Meer specifiek is het begrijpen van het transcriptoom essentieel voor het begrijpen van ontwikkeling en ziekte. RNA's kunnen zich echter op elk moment op verschillende rijpingsniveaus bevinden en kunnen de downstream-analyse bemoeilijken. Dit protocol maakt het mogelijk om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische subcellulaire fracties, wat kan helpen bij studies van RNA en een beter begrip van een bepaald RNA van belang mogelijk maakt, zoals de lokalisatie van niet-coderende RNA's of analyse van splice junctions binnen de kern.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's, waaronder mRNA's, rRNA's en lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), vanwege de grootteselectiviteit van de gebruikte RNA-zuiveringskolom, die kan worden gewijzigd om andere RNA's van belang te isoleren. Voorheen was de functie van lange RNA's, zoals mRNA's en lncRNA's, sterk afhankelijk van hun respectieve lokalisatie binnen de cel 4,5. Daarom is de studie van de export van de kern naar subcellulaire domeinen meer gericht op het begrijpen van de rol die het exporteren van RNA of andere cellulaire componenten op de cel kan hebben. lncRNA's dienen als een goed voorbeeld hiervan, omdat hun vertaling en daaropvolgende effecten grotendeels afhankelijk zijn van nabijheid en interacties met andere vormen van RNA6. Bovendien is de uitwisseling van cellulaire elementen tussen nucleaire en cytoplasmatische regio's gekoppeld aan resistentiemechanismen tegen verschillende kankerbehandelingen7. De isolatie van intracellulaire compartimenten heeft de ontwikkeling van nucleaire exportremmers mogelijk gemaakt, wat de effecten van resistentiemechanismen tegen verschillende therapieën heeft verminderd8.
Na het scheiden van nucleair en cytoplasmatisch RNA worden stappen uitgevoerd om het RNA van belang te zuiveren. Omdat RNA-zuiveringskits vaak worden aangetroffen in laboratoria en functioneren om lange RNA's te zuiveren en te isoleren, dienen ze het doel van dit protocol goed. Voor RNA-zuivering is het genereren van 260:280-verhoudingen groter dan 1,8 van cruciaal belang om de kwaliteit van monsters voor RNA-sequencing of andere soortgelijke procedures te waarborgen die een hoge mate van zuiverheid en isolatie vereisen. Onregelmatige 260:280-waarden wijzen op fenolbesmetting, die een slechte isolatie aantonen en onnauwkeurige resultaten opleveren9.
Zodra de RNA-zuivering is voltooid en 260:280-waarden boven een acceptabel bereik liggen, werd qPCR gebruikt om de isolatieresultaten van nucleaire en cytoplasmatische fracties te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het interessegebied om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In dit protocol werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als nucleaire en cytoplasmatische markers, respectievelijk10. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering met MALAT1 aan te tonen, terwijl cytoplasmatische fractionering naar verwachting laag zal zijn. Omgekeerd, wanneer TUG1 wordt gebruikt, wordt verwacht dat cytoplasmatische fractioneringsniveaus hoger zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus.
Met behulp van dit protocol was het mogelijk om RNA's te isoleren op basis van hun positie van actie in de cel. Vanwege de wijdverspreide toegang tot veel materialen en het gebruik van alleen lysisbuffer- en op dichtheid gebaseerde centrifugatietechnieken tijdens dit experiment, is de toepasbaarheid op andere RNA-typen en andere cellulaire componenten wijdverspreid. Dit kan belangrijke informatie opleveren door licht te werpen op locatiespecifieke expressiegebeurtenissen die anders zonder scheiding niet van elkaar te onderscheiden zouden zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
K562-cellen worden gebruikt voor deze studie. Dit protocol is geoptimaliseerd om te werken voor 1 x 106-5 x 106 miljoen cellen. De procedure kan echter worden opgeschaald voor grotere celhoeveelheden door de volumes op de juiste manier te verhogen.
1. Voorbereiding van de 0,25x lysisbuffer
- Bereid 0,25x lysisbuffer voor door de volgende componenten in tabel 1A te mengen.
OPMERKING: Monsters vereisen ongeveer 300 μL van 0,25x lysisbuffer. Aanbevolen volume = aantal monsters x 300 μL.
2. Scheiding van nucleaire en cytoplasmatische fracties
- Pellet de cellen met behulp van buizen van 1,5 ml via centrifugeren gedurende 5 minuten bij 2000 x g (kamertemperatuur). Gooi het supernatant weg met een aanzuigpipet.
OPMERKING: K562-cellen werden gebruikt tijdens dit protocol. Het protocol kan echter worden aangepast aan verschillende cellijnen. - Resuspendeerde de pellet in 300 μL ijskoude 0,25x lysisbuffer.
OPMERKING: Houd 2 minuten op ijs en draai de buis om de 45 s om een goede lysis van de cellen te garanderen. - Draai de buizen op de hoogste snelheid (12.000 x g) op 4 °C gedurende 2 minuten.
- Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant en plaats het in een nieuwe buis van 1,5 ml. Dit zal de cytoplasmatische fractie zijn. Ongeveer 300 μL van de cytoplasmatische fractie zal worden bereikt.
- De resterende pellet zal de kernfractie zijn. Voeg 500 μL ijskoude PBS toe aan de pellet en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 2.000 x g .
OPMERKING: Tijdens deze stap wordt overtollig DNA verwijderd.
3. RNA-opruiming met behulp van een RNA-zuiveringskit
OPMERKING: Dit protocol werd bereikt met behulp van een in de handel verkrijgbare RNA-zuiveringskit (zie materiaaltabel).
- Scheid de cytoplasmatische RNA-monsters en de nucleaire cytoplasmatische monsters (omdat de fractioneringsstappen tussen hen variëren).
- Om de cytoplasmatische fractie te scheiden, voegt u 1.050 μL 3,5x RLT-lysisbuffer (zie materiaaltabel) en vortex kort toe. Voeg vervolgens 750 μL 90% ethanol toe en laad het op de kolom van de RNA-opruimkit.
OPMERKING: De oplossing moet goed worden gemengd voordat deze op de kolom wordt geladen. - Om de kernfractie te scheiden, voegt u 600 μL 3,5x lysisbuffer en vortex toe. Voeg vervolgens 600 μL 70% ethanol toe.
- Om de cytoplasmatische fractie te scheiden, voegt u 1.050 μL 3,5x RLT-lysisbuffer (zie materiaaltabel) en vortex kort toe. Voeg vervolgens 750 μL 90% ethanol toe en laad het op de kolom van de RNA-opruimkit.
- Laad zowel cytoplasmatische als nucleaire fracties op RNA-kolommen (zie tabel met materialen).
OPMERKING: Voor de rest van stap 3 volgen zowel de cytoplasmatische als de nucleaire monsters dezelfde procedure. Zorg er echter voor dat deze monsters onafhankelijk van elkaar blijven.- Laad zowel cytoplasmatische als nucleaire fracties op RNA-kolommen en draai gedurende 30 s bij 8.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi de overtollige stroom door.
- Voeg 350 μL wasbuffer toe uit een in de handel verkrijgbare zuiveringskit (RW1-buffer, zie materiaaltabel), draai opnieuw en gooi de stroom door.
- Voeg DNAse-oplossing (1U/uL) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toe. Voeg vervolgens 350 μL wasbuffer toe, draai opnieuw en gooi de stroom erdoorheen.
- Voeg 500 μL milde wasbuffer (RPE, zie Tabel met materialen) toe, draai opnieuw en gooi de stroom door. Voeg 500 μL milde wasbuffer toe, draai opnieuw, maar slechts gedurende 2 minuten.
- Verplaats de kolom naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg 30 μL water toe aan de spinkolom. Laat de kolom 1 minuut zitten voordat je gaat draaien.
4. Validatie van nucleair-cytoplasmatische scheiding
- Voer cDNA-synthese uit
- Zodra subcellulaire compartimenten van RNA zijn geëxtraheerd en gezuiverd, bevestigt u de scheiding van de compartimenten met behulp van qPCR. Om dit te doen, zet u eerst het RNA om in cDNA met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
- Bereid reverse transcriptase mastermix voor. Voeg sjabloon-RNA toe. Incubeer reacties in een thermocycler.
OPMERKING: Voor willekeurige hexameerapparaten zijn de gebruikte fietsparameters weergegeven in tabel 2A. Gebruik de reverse transcriptasereactie onmiddellijk of bewaar bij -20 °C (tabel 1B).
- Voer de kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en analyse uit.
- Verdun de cDNA-synthese met DEPC-water (zie materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 20 ng/ml.
- Bereid met behulp van een PCR-hoofdmix de reactie voor elk monster voor met behulp van handmatige instructies zoals hieronder vermeld.
- Verkrijg commerciële sondes die nodig zijn om cytoplasmatische en nucleaire fractionering te detecteren. Gebruik MALAT1 als nucleaire marker en TUG1 als cytoplasmatische marker (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Sequenties voor MALAT1 en TUG1 zijn opgenomen in tabel 3. - Bereken het volume van elke component door elke component te vermenigvuldigen met 3 voor elk van de technische replicaties voor het individuele monster.
- Verkrijg voor elk nucleair en cytoplasmatisch monster de volgende mengsels voor elk: (a) Nucleaire fractie met MALAT1, (b) Cytoplasmatische fractie met MALAT1, (c) Nucleaire fractie met TUG1 en (d) Cytoplasmatische fractie met TUG1 (tabel 1C).
- Vortex kort om oplossingen te mengen en 20 μL van het mengsel over te brengen naar elke put van een optische reactieplaat (zie tabel met materialen).
- Bedek de plaat met een heldere kleeffilm die wordt gebruikt voor qPCR (zie materiaaltabel) en centrifugeer de plaat kort om luchtbellen te verwijderen en draai het monster vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g naar beneden.
- Selecteer met behulp van ontwerp- en analysesoftware (zie materiaaltabel) de standaardcurve voor de cyclusparameters (tabel 2B).
- Gebruik qPCR-software en selecteer Run instellen (aanvullende afbeelding 1).
- Selecteer op de pagina Eigenschappen van gegevensbestand de optie Parameters voor methode en invoercyclus in tabel 2B (aanvullende afbeelding 2).
- Nadat u cyclusparameters hebt ingevoerd, selecteert u het tabblad Plaat en voert u de uit te voeren monsters in (aanvullende afbeelding 3). Selecteer Uitvoering starten.
OPMERKING: De beschreven stappen zijn uitgevoerd in een qPCR-machine met behulp van een in de handel verkrijgbare mastermix (zie Materiaaltabel).
- Voer data-analyse uit
- Nadat de uitvoering is voltooid, maakt u een gegevensspreadsheet met de voorbeeldnaam, doelnaam en kwantificeringscyclus (Cq) (aanvullende tabel 1).
- Begin met de MALAT1-monsters om de kernfractie te berekenen. Trek de MALAT1 cytoplasmatische fractie af van de MALAT1 kernfractie (tabel 4).
- Bereken vervolgens de ΔCq (2^(-waarde)) (tabel 5).
- Ga verder met de MALAT1-monsters om de cytoplasmatische fractie te berekenen, trek de MALAT1-kernfractie af van de MALAT1-cytoplasmatische fractie en bereken vervolgens de ΔCq (2 ^ (-waarde)) (tabel 6).
OPMERKING: Kijkend naar de ΔCq, wordt waargenomen dat de nucleaire MALAT1-fractie (groene highlight) een grotere MALAT1-marker heeft dan het cytoplasma (rode highlight), maar nu is bevestiging vereist om ervoor te zorgen dat de cytoplasmatische fractie overwegend cytoplasma is en dat de nucleaire fractie geen cytoplasmatische contaminatie bevat. - Voer met TUG1-monsters dezelfde berekening uit als hierboven (stappen 4.3.2-4.3.4) (tabel 7).
OPMERKING: Kijkend naar de ΔCq, wordt waargenomen dat de cytoplasmatische TUG1-fractie (groene highlight) een grotere TUG1-marker heeft dan de nucleaire fractie (rode highlight), wat een goede scheiding van cytoplasmatische en nucleaire fracties bevestigt (tabel 8, figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om er zeker van te zijn dat nucleaire en cytoplasmatische isolatie was bereikt, werd een qPCR uitgevoerd om de resultaten te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het gebied van belang om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In deze studie werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als respectievelijk nucleaire en cytoplasmatische primers. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering aan te tonen met MALAT1 als een positieve controle voor nucleaire elementen, terwijl cytoplasmatische fractionering naar verwachting laag zal zijn. Omgekeerd, wanneer TUG1 aanwezig is als een positieve controle voor cytoplasmatische elementen, dan wordt verwacht dat cytoplasmatische fractioneringsniveaus hoger zullen zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus. Dit is te zien in figuur 2, een voorbeeld van een positief resultaat dat nucleaire en cytoplasmatische RNA-scheiding bevestigt.
Een negatief resultaat is te zien in figuur 3, waarin niveaus van cytoplasmatische fractionering worden waargenomen in het monster met MALAT1. Dit duidt op besmetting van RNA geïsoleerd uit de kernfractie, mogelijk als gevolg van lysisconcentraties die te laag of te hoog zijn. Deze studie testte ook andere primers, maar MALAT1 en TUG1 vertoonden de hoogste correlatie met nucleaire en cytoplasmatische scheiding, zoals bevestigd door een western blot en RNA-elektroforese, die de zuiverheid en kwaliteit van de monsters bevestigden (figuur 4 en figuur 5).
Bovendien kan de zuiverheid van nucleaire en cytoplasmatische extracten worden aangetoond door een western blot met lamin als marker voor kernfractie en alfa-tubuline als positieve marker voor de cytoplasmatische fractie10, zoals weergegeven in figuur 4. Er is een duidelijke expressie van lamin uitsluitend binnen de kernfractie, met een duidelijke expressie van alfa-tubuline in de cytoplasmatische fractie, wat wijst op relatieve zuiverheid binnen elk monster.
Vanwege de neiging van RNA om af te breken tijdens het proces van qPCR, is het noodzakelijk om de kwaliteit van de RNA-opbrengst te bevestigen met behulp van RNA-elektroforese. RNA-elektroforese werd uitgevoerd en toonde een hoge kwaliteit van RNA aan vanwege de aanwezigheid van een piek in de 32S-rRNA-subeenheid, een kenmerk dat alleen aanwezig is in nucleaire fracties. De aanwezigheid van deze piek duidt op nucleaire zuiverheid en voldoende fractionering. Omgekeerd werd geen piek waargenomen in de cytoplasmatische RNA-elektroforese, wat een hoge kwaliteit en weinig of geen contaminatie in het cytoplasmatisch RNA-monster11 aantoonde (figuur 5).
Figuur 1: Schema van protocolstappen. Nadat cellen zijn behandeld, worden ze gelyseerd en gecentrifugeerd voor isolatie. Vervolgens wordt RNA-isolatie uitgevoerd en wordt cDNA gegenereerd vóór de validatie van isolatie met behulp van qPCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Positieve resultaatgegevens. De figuur benadrukt het succes van het protocol dat wordt getoond door hoge niveaus van scheiding van nucleaire en cytoplasmatische componenten. MALAT1, een nucleaire RNA-primer, vertoonde statistisch significant hogere niveaus van de kernfractie. In TUG1, een cytoplasmatische RNA-primer, werden statistisch significante hogere niveaus van cytoplasmatische fractie waargenomen. In beide steekproeven werd een hoge statistische significantie waargenomen via de t-test. p < 0,0001. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Negatieve resultaatgegevens. De figuur toont een voorbeeld van negatieve resultaten met behulp van protocol die worden getoond door hoge niveaus van scheiding van nucleaire en cytoplasmatische componenten. MALAT1, een nucleaire RNA-primer, vertoonde cytoplasmatische fractieniveaus veroorzaakt door nucleaire besmetting. Er worden geen verschillen waargenomen in statistische significantie tussen de breuken via t-test. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Western Blot die de zuiverheid van cytoplasmatische en nucleaire fracties aantoont. De figuur toont een westelijke vlek van de nucleaire en cytoplasmatische fracties. Lamin werd gebruikt om de zuiverheid van het nucleaire monster te verifiëren, terwijl alfa-tubuline werd gebruikt om de zuiverheid van de cytoplasmatische fractie aan te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bevestiging van RNA-zuiverheid van cytoplasmatische en nucleaire fracties via RNA-elektroforese. (A) RNA-elektroforese van de kernfractie. Arrow demonstreert 32S-rRNA, dat alleen in kernfracties wordt waargenomen. (B) RNA-elektroforese van de cytoplasmatische fractie. De afwezigheid van een 32S-piek duidt op RNA-zuiverheid van cytoplasmatische fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van lysisbuffer, reactiemengsels en monsters. (A) Samenstelling van 0,25x lysisbuffer. (B) Samenstelling van reverse transcriptase mix gebruikt tijdens transcriptie van RNA naar cDNA. (C) Samenstelling van nucleaire en cytoplasmatische monsters met behulp van een reverse transcriptasekit. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Cyclische parameters. (A) De fietsparameters voor thermocycler. Deze parameters werden gebruikt tijdens qPCR voor versterking van de doelsequentie. (B) De cyclusparameters voor nucleaire en cytoplasmatische monsters. Deze parameters werden gebruikt tijdens qPCR voor versterking van de doelsequentie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Sequenties van nucleaire en cytoplasmatische markers. De tabel bevat de sequenties van de markers die worden gebruikt om nucleaire en cytoplasmatische scheiding te bevestigen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Procedure voor het aftrekken van MALAT1 nucleaire en cytoplasmatische fracties. Een voorbeeld van een gegevensblad dat wordt gebruikt om MALAT1-kernfractie af te trekken - MALAT1-cytoplasmatische fractie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: Procedure voor de berekening van ΔCq (2^(-waarde). Een voorbeeld van het gegevensblad dat wordt gebruikt om de ΔCq (2^(-waarde)) te berekenen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: Procedure voor het berekenen van cytoplasmatische fractie. Een voorbeeld van het gegevensblad dat wordt gebruikt om de cytoplasmatische fractie te berekenen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 7: Procedure voor de berekening van de kernfractie. Een voorbeeld van het gegevensblad dat wordt gebruikt om de kernfractie te berekenen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 8: Procedure voor het bevestigen van een succesvol fractioneringsresultaat. Een voorbeeld van een gegevensblad dat wordt gebruikt om succesvolle fractionering te verifiëren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Afbeelding van qPCR-machineontwerp- en analysesoftware. Een afbeelding die de werking van de qPCR-machine demonstreert. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Afbeelding van qPCR "Data file properties". Een afbeelding die de procedure voor het instellen van parameters voor qPCR-uitvoering demonstreert. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Afbeelding van het laden van monsters in de qPCR-machine. Een afbeelding die de procedure demonstreert voor het toevoegen van monsters aan de qPCR-software voor analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Voorbeeldnaamgegevensblad. Een voorbeeld van een gegevensblad met de voorbeeldnaam, doelnaam en Cq-waarde. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gedurende het protocol werden enkele stappen ondernomen om de elementen te optimaliseren om het meest effectief te zijn voor de cellijn van belang. Hoewel de stappen binnen het protocol relatief eenvoudig zijn, kunnen analyse en kleine aanpassingen tijdens kritieke aspecten van het protocol nodig zijn. De meest kritische stap in het protocol is het wijzigen van de concentratie van de lysisbuffer tot een juiste concentratie op basis van de cellijn van belang en het cellulaire doelwit. Aangezien het gebruik van lysisbuffer grotendeels afhangt van de verstoring van celmembranen, is er natuurlijke variantie in de effectiviteit van lysisbuffer op verschillende cellijnen, omdat er kleine verschillen zijn in celkwetsbaarheid en membraanpermeabiliteit tussen verschillende cellijnen12. Beginnend met een baseline van 1x lysisbuffer, werden de stappen in het protocol uitgevoerd terwijl de concentratie van de lysisbuffer geleidelijk werd verlaagd tot 0,25x, wat effectievere resultaten rechtvaardigde. Aangezien het experiment tot doel heeft om uiteindelijk een groot aantal subcellulaire componenten te isoleren, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de concentratie van lysisbuffer wordt geoptimaliseerd voor de cellijn van belang om de hoogste opbrengst en de beste resultaten te bereiken.
Naast de aanpassing van lysisbufferconcentraties, is het belangrijk om de kwetsbaarheid van RNA en stressvoorzichtigheid tijdens de isolatie van RNA op te merken. RNA is kwetsbaarder voor afbraak dan DNA en vele andere cellulaire elementen, omdat de 2'-hydroxylgroep kan dienen als bindingspunt voor RNases, een familie van enzymen die RNA kunnen afbreken en tot slechte resultaten kunnen leiden. RNasen zijn zeer goed in staat tot RNA-afbraak, zelfs wanneer ze in kleine hoeveelheden worden gepresenteerd13. Aangezien RNases tijdens en na lysisstappen uit cellen vrijkomen, moet voorzichtigheid worden betracht om besmetting te voorkomen, wat kan leiden tot ongewenste RNA-afbraak14. De stappen omvatten het dragen van handschoenen tijdens het experiment en deze vaak te vervangen om te voorkomen dat RNases van de omgeving of oppervlakken naar monsters worden verzonden. Bovendien moeten RNase-vrije oplossingen worden gebruikt en moet een aparte werkruimte worden gebruikt bij het verwerken van RNA. Ten slotte, omdat RNase zeer resistent kan zijn tegen lysisbuffer en denaturatie, kunnen RNaseremmers worden gebruikt om hun negatieve effecten op RNA-isolatie te verminderen15.
Hoewel de stappen tijdens het protocol zeer succesvolle resultaten opleverden, zijn er enkele beperkingen. Om te beginnen, terwijl RNA en cytoplasmatische componenten grotendeels van elkaar kunnen worden geïsoleerd, kunnen de twee niet volledig worden gescheiden zonder de kwaliteit van het RNA voor onderzoek in gevaar te brengen. Hierdoor kan elke conclusie op basis van verschillen in de activiteit of functie van moleculen uit deze afzonderlijke regio's enigszins worden vertekend door het onvermogen om volledig geïsoleerde monsters af te leiden. Het is ook belangrijk op te merken dat als het protocol is aangepast aan andere celmoleculen, zoals eiwitten, sommige eiwitten of andere cellulaire elementen kunnen worden afgebroken tijdens de scheiding van nucleaire extracten, wat leidt tot een verlies van activiteit en de resultaten beïnvloedt16. Het is ook belangrijk op te merken dat tijdens dit protocol qPCR van de nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van MALAT1 en TUG1 eenvoudigweg werden uitgevoerd als validatie van de zuiverheid en kwaliteit van de monsters. Om dit idee uit te breiden, werden de relatieve verhoudingen van nucleair en cytoplasmatisch RNA niet geanalyseerd of vergeleken tijdens dit protocol, omdat het uitsluitend werd gebruikt voor validatie. Dit protocol kan echter worden aangepast aan andere toepassingen, zoals het vergelijken van de relatieve verhoudingen van nucleaire en cytoplasmatische fracties, maar deze waarden moeten worden genormaliseerd tot de hoeveelheid totaal RNA voor een nauwkeurige analyse of vergelijking. De stappen voor het normaliseren van de cytoplasmatische en nucleaire fracties tot totale RNA-niveaus zijn eerder beschreven in andere protocollen11.
Zoals eerder vermeld, maakt deze methode echter gebruik van gemeenschappelijke laboratoriummaterialen om op kosteneffectieve wijze hoogwaardige RNA-extracten te genereren. Ook blijkt deze methode voor het bestuderen van nucleaire en cytoplasmatische interacties een van de meest tijdbesparende procedures te zijn. Het gebruik van RNA-zuiverheidskits leidt tot zeer effectieve RNA-opschoning en helpt bij het waarborgen van hoge niveaus van RNA-isolatie uit verschillende cellulaire regio's, wat leidt tot effectievere monsters om te bestuderen. Ten slotte presenteert het aanpassingsvermogen van dit protocol zich als een belangrijk voordeel, omdat het wijzigen van de lysisbufferconcentratie toegang kan geven tot de studie van veel verschillende cellijnen, en een dichtheidsscheidingstechniek zoals centrifugatie kan leiden tot de isolatie van verschillende cellulaire elementen. Naarmate studies naar cytoplasmatische en nucleaire interacties wijdverspreider worden, kan de impact van lokalisatie op cellulaire componenten beter worden begrepen. De uitwisseling tussen het cytoplasma en de kern kan worden geanalyseerd, wat aangeeft of bepaalde moleculen tijdens deze uitwisselingen kunnen leiden tot de ontwikkeling van kanker, zoals studies over nucleaire eiwitten zoals XPO1 hebben aangegeven17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Ondersteund door subsidies van de American Society of Hematology, de Robert Wood Johnson Foundation, de Doris Duke Charitable Foundation, de Edward P. Evans Foundation en het National Cancer Institute (1K08CA230319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D.
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. Bacterial Cell Wall. , Elsevier. (1994).
- Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
- Blumberg, D. D.
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, Supplement 1 233 (2018).
