Expression von Transgenen im nativen Blasenurothel mittels Adenovirus-vermittelter Transduktion

Das Urothel ist das spezialisierte Epithel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhre^{auskleidet 1}. Es besteht aus drei Schichten: einer Schicht hochdifferenzierter und polarisierter, oft zweikerniger Schirmzellen, deren apikale Oberflächen in Urin gebadet sind; eine intermediäre Zellschicht mit einer Population von zweikernigen transitamplifizierenden Zellen, die als Reaktion auf ihren akuten Verlust zu oberflächlichen Regenschirmzellen führen können; und eine einzelne Schicht von Basalzellen, von denen eine Teilmenge als Stammzellen fungiert, die das gesamte Urothel als Reaktion auf chronische Verletzungen regenerieren können. Regenschirmzellen sind hauptsächlich für die Bildung der hochresistenten Urothelbarriere verantwortlich, zu deren Bestandteilen eine apikale Membran (reich an Cholesterin und Cerebrosiden) mit geringer Durchlässigkeit für Wasser und gelöste Stoffe sowie ein hochresistenter apikaler Verbindungskomplex (bestehend aus Tight Junctions, Adherens Junctions, Desmosomen und einem zugehörigen Actomyosin-Ring) ^gehören1 . Sowohl die apikale Oberfläche der Regenschirmzelle als auch ihr Verbindungsring dehnen sich während der Blasenfüllung aus und kehren nach dem Entleeren von 1,2,3,4,5 schnell in ihren vorgefüllten Zustand zurück. Zusätzlich zu seiner Rolle in der Barrierefunktion wird angenommen, dass das Urothel auch sensorische und Wandlerfunktionen hat, die es ihm ermöglichen, Veränderungen im extrazellulären Milieu (z. B. Dehnung) zu erfassen und diese Informationen über die Freisetzung von Mediatoren (einschließlich ATP, Adenosin und Acetylcholin) an darunter liegende Gewebe zu übertragen, einschließlich suburothelialer afferenter Nervenprozesse ^6,7,8 . Neuere Beweise für diese Rolle finden sich bei Mäusen, denen die urotheliale Expression von Piezo1 und Piezo2 fehlt, was zu einer veränderten Hohlraumfunktion^{führt 9}. Darüber hinaus entwickeln Ratten, die das porenbildende Protein CLDN2 in der Regenschirmzellschicht überexprimieren, Entzündungen und Schmerzen, die denen bei Patienten mit interstitieller Zystitis entsprechen¹⁰. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass eine Störung der urothelialen Sensorik/Transducer- oder Barrierefunktion zu mehreren Blasenstörungen beitragen kann ^6,11.

Ein besseres Verständnis der Biologie des Urothels in normalen und Krankheitszuständen hängt von der Verfügbarkeit von Werkzeugen ab, die es den Forschern ermöglichen, die endogene Genexpression leicht herunterzuregulieren oder die Expression von Transgenen im nativen Gewebe zu ermöglichen. Während ein Ansatz zur Herunterregulierung der Genexpression darin besteht, bedingte Urothel-Knockout-Mäuse zu erzeugen, hängt dieser Ansatz von der Verfügbarkeit von Mäusen mit floxierten Allelen ab, ist arbeitsintensiv und kann Monate bis Jahre dauern, bis er abgeschlossen ist¹². Es überrascht daher nicht, dass Forscher Techniken entwickelt haben, um das Urothel zu transfizieren oder zu transduzieren, was zu Ergebnissen auf einer kürzeren Zeitskala führen kann. Veröffentlichte Methoden zur Transfektion umfassen die Verwendung von kationischen Lipiden¹³, Antisense-phosphorothioierten Oligodesoxynukleotiden¹⁴ oder Antisense-Nukleinsäuren, die an das HIV-TAT-Protein gebunden sind, das das 11-mer-Peptid¹⁵ durchdringt. Der Schwerpunkt dieses Protokolls liegt jedoch auf der Verwendung der adenoviral-vermittelten Transduktion, einer gut untersuchten Methodik, die bei der Genabgabe an ein breites Spektrum von Zellen effizient ist, in zahlreichen klinischen Studien getestet wurde und zuletzt verwendet wurde, um die cDNA, die für das COVID-19-Kapsidprotein kodiert, an Empfänger einer Variante des COVID-19-Impfstoffs zu liefern^{16, 17}. Sonstiges Für eine ausführlichere Beschreibung des Lebenszyklus des Adenovirus, der adenoviralen Vektoren und der klinischen Anwendungen von Adenoviren wird der Leser auf Referenz¹⁷ verwiesen.

Ein wichtiger Meilenstein bei der Verwendung von Adenoviren zur Transduktion des Urothels war ein Bericht von Ramesh et al., der zeigte, dass kurze Vorbehandlungen mit Detergenzien, einschließlich N-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM), die die Transduktion des Urothels durch ein Adenovirus, das für β-Galactosidase¹⁸ kodiert, dramatisch verbesserten. Unter Verwendung dieser Proof-of-Principle-Studie wurde nun die adenoviral vermittelte Transduktion des Urothels verwendet, um eine Vielzahl von Proteinen zu exprimieren, darunter GTPasen der Rab-Familie, Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, Myosin-Motorfragmente, porenbildende Tight-Junction-assoziierte Claudine und ADAM17 10,19,20,21,22 . Derselbe Ansatz wurde angepasst, um kleine interferierende RNAs (siRNA) zu exprimieren, deren Effekte durch die Co-Expression von siRNA-resistenten Varianten des Transgens²² gerettet wurden. Das hier beschriebene Protokoll umfasst allgemeine Methoden zur Erzeugung großer Mengen hochkonzentrierter Adenoviren, eine Voraussetzung für diese Techniken, sowie Anpassungen der Methoden von Ramesh et ^al.18, um Transgene im Urothel mit hoher Effizienz zu exprimieren.

Experimente zur Erzeugung von Adenoviren, für die eine BSL2-Zertifizierung erforderlich ist, wurden mit Genehmigung der Umweltgesundheits- und Sicherheitsbüros der University of Pittsburgh und des Institutional Biosafety Committee durchgeführt. Alle durchgeführten Tierversuche, einschließlich der adenoviralen Transduktion (für die eine ABSL2-Zertifizierung erforderlich ist), wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien/Vorschriften der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und des Tierschutzgesetzes sowie mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh durchgeführt. Handschuhe, Augenschutz und entsprechende Kleidung werden bei allen Eingriffen mit rekombinanten Viren getragen. Flüssige oder feste Abfälle sollten wie unten beschrieben entsorgt werden. Die Einstreu der Tiere nach der Transduktion und alle daraus resultierenden Tierkadaver sollten als biologisch gefährliche Stoffe behandelt und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

1. Präparation von Adenovirus-Vorräten mit hohem Titer

HINWEIS: Die effektive Transduktion von Nagetierblasen hängt von der Verwendung gereinigter und konzentrierter Virusvorräte ab, typischerweise 1 x 10⁷ bis 1 x 10⁸ infektiöse Viruspartikel (IVP) pro μl. Dieser Teil des Protokolls konzentriert sich auf die Generierung von Adenovirus-Vorräten mit hohem Titer aus bestehenden Viruspräparaten. Alle Schritte sollten in einer Zellkulturhaube mit sterilen Reagenzien und Werkzeugen durchgeführt werden. Während die heute verwendeten verfügbaren Adenovirus-Stämme replikationsfehlerhaft sind, benötigen die meisten Institutionen eine Genehmigung für die Verwendung von Adenoviren und rekombinanter DNA. Dazu gehört häufig die Ausweisung eines Zellkulturraums als BSL2-zugelassene Einrichtung zur Herstellung und Amplifikation von Adenoviren. Einige allgemeine Überlegungen umfassen die Verwendung von Masken, Augenschutz, Handschuhen und geeigneter Kleidung in allen Phasen der Virusproduktion und -reinigung. Bei der Zentrifugation werden Sicherheitskappen empfohlen, wenn die Zentrifugenröhrchen keine dicht schließenden Kappen haben. Alle Einwegmaterialien, einschließlich potenziell kontaminierter Zentrifugen-Sicherheitskappen, Flaschen und Rotoren, werden mit einer antiviralen Lösung behandelt (siehe Materialtabelle) und dann mit Wasser oder 70% Ethanol gespült. Flüssige Abfälle werden durch Zugabe von Bleichmittel bis zu einer Endkonzentration von 10% (v/v) behandelt. Die Entsorgung dieser flüssigen Abfälle hängt von der institutionellen Politik ab. Feste Abfälle werden in der Regel in biologisch gefährlichen Abfällen entsorgt.

1. Kultur von HEK293T-Zellen
   1. Tauen Sie ein gefrorenes Fläschchen mit HEK293T-Zellen in einem Wasserbad bei 37 °C auf und verwenden Sie eine 5-ml-Pipette, um die Zellen in eine Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 15 cm zu überführen. Geben Sie mit einer 25-ml-Pipette langsam 20 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum und Penicillin/Streptomycin-Antibiotikum (DMEM-FBS-PS) in die Schale. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Zellkultur-Inkubator, der mit 5% (v/v) CO₂ begast ist, bis sie eine Konfluenz von 80% -90% erreichen (~2 x 10⁷ Zellen).
   2. Saugen Sie das Medium mit einer Glaspipette ab, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, und spülen Sie dann die Zellen aus, indem Sie 20 ml steriles PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl und 8,9 mM Na₂HPO₄) mit einer 25-ml-Pipette in die Schale geben. Aspirieren Sie das verbrauchte PBS und geben Sie dann mit einer 5-ml-Pipette 3 ml warme (37 °C) Proteinaselösung (siehe Materialtabelle) in die Schale und inkubieren Sie die Schale im Zellkulturinkubator, bis sich die Zellen lösen (~3-4 min).
      HINWEIS: Eine effektive Proteolyse kann am besten beurteilt werden, indem die Schale langsam hin und her gekippt wird, um nach der Freisetzung von Zellen aus allen Teilen der Schale in die sich bewegende Flüssigkeit zu suchen. HEK293T-Zellen reagieren empfindlich auf eine verlängerte Proteinase-Behandlung und sterben ab, wenn sie länger als ein paar Minuten in Proteinaselösung belassen werden.
   3. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um 7 ml DMEM-FBS-PS in die Schale mit abgelösten Zellen zu überführen, und verwenden Sie dann dieselbe Pipette, um die Zellen und das Medium abzusaugen. Übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen dann, indem Sie die Suspension in einer klinischen Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit bei 200 x g für 5 Minuten zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand mit einer Glaspipette ab, die an einer Vakuumquelle befestigt ist. Verwenden Sie eine 25-ml-Pipette, um das Zellpellet in 15 ml DMEM-FBS-PS zu resuspendieren.
   4. Geben Sie 1 ml der Zellsuspension in jede der fünfzehn 15-cm-Schalen mit 19 ml DMEM-FBS-PS.
   5. Züchten Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator, bis sie 85%-90% Konfluenz erreichen (~3-4 Tage).
2. Bereiten Sie eine verdünnte Viruslösung vor
   1. Fügen Sie ~ 1,5 x 10 9 bis 3 x 10⁹ IVP eines vorhandenen Virusvorrats (5-10 IVP / Zelle) zu einem konischen 50-ml-Röhrchen hinzu, das mit 45 ml DMEM ohne FBS oder Antibiotika gefüllt ist.
      HINWEIS: Es ist möglich, eine niedrigere Konzentration des Virus (1-5 IVP / Zelle) zu verwenden. Es wird jedoch länger dauern, bis die Virusproduktion einsetzt.
3. Infizieren Sie die kultivierten Zellen mit dem Virus.
   1. Mit einer Glaspipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, wird das Medium in Schritt 1.1.5 aus den fast konfluenten Zellen abgesaugt.
   2. Verwenden Sie eine 25-ml-Pipette, um 3,0 ml verdünnte Viruslösung (hergestellt in Schritt 1.2.1) in jede Zellkulturschale zu überführen. Verwenden Sie dann eine 10-ml-Pipette, um 7,0 ml DMEM-Medium (ohne FBS oder Antibiotika) zu jeder Schale zu geben. Inkubieren Sie 60 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator und geben Sie dann 10 ml DMEM mit 20% (v/v) FBS und 2x PS in jede Schale.
      HINWEIS: Die Verwendung einer der 15 Schalen als Kontrollplatte (in der kein Virus hinzugefügt wird) erleichtert die Identifizierung von virusinduzierter Zellrundung und Zelltod in infizierten Zellen im nächsten Schritt.
   3. Inkubieren Sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator für 2-4 Tage, bis die Mehrheit von ihnen zu runden beginnt und >60% der Zellen sich gelöst haben.
      HINWEIS: Wenn Sie einen niedrigeren Titer des Virus verwenden, kann es bis zu einer Woche dauern, bis der Zelltod eintritt. Wenn der Zelltod nicht innerhalb einer Woche eintritt, ist es wahrscheinlich, dass der Vorgang mit einem höheren Titer des Virus wiederholt werden muss.
4. Rückgewinnung von Viren aus Zelllysaten
   1. Verwenden Sie einen Zellschaber, um den Boden jeder Schale abzukratzen und anhaftende Zellen in das Medium freizugeben.
   2. Sammeln Sie mit einer 25-ml-Pipette das Medium, die Zellen und die Zelltrümmer aus jeder Zellkulturschale und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Zellkulturröhrchen.
      HINWEIS: Um Ressourcen zu sparen, kann das Medium aus zwei Schalen in einem 50-ml-Röhrchen kombiniert werden.
   3. Pelletieren Sie das Zellmaterial durch Zentrifugation mit einer Tischzentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit: 5 min bei Raumtemperatur bei 3.000 x g. Verwenden Sie eine Glaspipette, die an einem Vakuumgerät befestigt ist, um den Überstand abzusaugen.
   4. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette in Kombination mit einer Verreibung, um das gesamte resultierende pelletierte Material in insgesamt 7 ml sterilfiltriertem 100 mM Tris-HCl pH 7,4 mit 10 mM EDTA (Tris-EDTA-Lösung) zu konsolidieren. Übertragen Sie das gepoolte Material in ein steriles konisches 15-ml-Zellkulturröhrchen und legen Sie es auf Eis.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Virusvorbereitung unbegrenzt bei -80 °C eingefroren werden.
5. Zelllysate vorbereiten
   1. Führen Sie drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, um die verbleibenden Zellen zu zerstören und so die gebildeten Viruspartikel weiter freizusetzen. Das gepoolte Material wird in Schritt 1.4.4 eingefroren, indem das Röhrchen in flüssigen Stickstoff getaucht wird (~30-60 s). Tauen Sie die Probe schnell auf, indem Sie das Röhrchen in einen 37 °C heißen Inkubator geben. Wirbeln Sie die Probe 15 s lang und wiederholen Sie dann den schnellen Gefrier- und Auftauvorgang weitere 2x.
      HINWEIS: Die Viruslösung kann bei 37 °C in einem Wasserbad schnell aufgetaut werden, es ist jedoch Vorsicht geboten, da die Temperaturschwankungen dazu führen können, dass das Röhrchen reißt und die Viruslösung in das Wasserbad gelangt. Um dies zu verhindern, legen Sie das Röhrchen mit dem Virusüberstand in ein größeres Röhrchen, das dann in das Wasserbad gestellt wird.
   2. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um das dreimal gefrieraufgetaute Zellmaterial in ein Superspeed-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Zentrifugieren Sie das Material im Röhrchen für 30 min bei 4 °C, Zentrifuge mit Supergeschwindigkeit bei ~18.500 x g.
   3. Die ~7 ml des virusreichen Überstands werden mit einer 10-ml-Pipette zurückgewonnen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Bewahren Sie die Probe bis zum nächsten Schritt auf Eis auf.
      HINWEIS: Erwägen Sie an dieser Stelle, ein Aliquot des ungereinigten Virusüberstands als Präambel für den Start einer neuen Virusvorbereitung (oder als Backup) aufzubewahren. Lagern Sie dieses Aliquot bei -80 °C.
6. Isolieren und reinigen Sie das Virus mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation.
   1. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Gradienten von CsCl in einem dünnwandigen, klaren 12-ml-PET-Ultrazentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) oder einem gleichwertigen Röhrchen vor. Verwenden Sie eine 3-ml-Spritze, die mit einer 18-g-Nadel ausgestattet ist, um vorsichtig 2,5 ml 1,4 g/ml CsCl-Lösung in den Boden des Röhrchens einzuführen, und verwenden Sie dann eine neue Spritze/Nadel, um sie mit 2,5 ml 1,25 g/ml CsCl-Lösung zu schichten.
      HINWEIS: Das Abtropfen von Lösungen direkt auf eine bereits vorhandene Schicht führt zu einer erheblichen und unerwünschten Vermischung. Legen Sie stattdessen den abgeschrägten Teil der Nadel gegen den Rand des Röhrchens und drücken Sie dann sehr langsam auf den Spritzenkolben, wobei Sie die Position der Nadel erhöhen, während die Lösung das Röhrchen füllt.
   2. Laden Sie den ~7 ml Virusüberstand auf ähnliche Weise mit einer 10-ml-Spritze auf den Gradienten. Wenn zwischen dem Virusüberstand und der Oberseite des Röhrchens mehr als 2-3 mm Abstand ist, fügen Sie zusätzliche Tris-EDTA-Lösung hinzu, um das Röhrchen zu füllen, bis nur noch 2-3 mm Platz verbleiben.
   3. Stellen Sie ein ähnlich vorbereitetes Ausgleichsröhrchen her, das CsCl-Schichten enthält, aber den Virusüberstand durch Tris-EDTA-Lösung ersetzt.
      HINWEIS: Die beiden Röhrchen müssen identische Gewichte (und ähnliche Dichten) haben, um eine potenziell gefährliche Unwuchtbelastung in der Ultrazentrifuge zu vermeiden.
7. Isolieren Sie das Virus mit geschwindigkeitszonaler Ultrazentrifugation.
   1. Laden Sie die in den Schritten 1.6.2 bis 1.6.3 gebildeten Gradienten in die Schaufeln eines SW41-Rotors oder eines gleichwertigen Rotors. Becherverschlüsse einschrauben, Rotor in eine Ultrazentrifuge (vorgekühlt auf 4 °C) geben und 1 h bei ~150.000 x g zentrifugieren.
   2. Während der Zentrifugation wird die in Schritt 1.9.1 beschriebene Säule äquilibriert.
8. Rückgewinnung isolierter Viruspartikel
   1. Nehmen Sie am Ende des Zentrifugationsschritts die Eimer vorsichtig vom Rotor ab und entfernen Sie in einer Zellkulturhaube die Eimerkappen, entfernen Sie dann die Röhrchen und legen Sie sie in ein Gestell.
   2. Sammeln Sie das gebänderte Material, das reich an Viruspartikeln ist und an der Grenzfläche zwischen der 1,25 g/ml und 1,4 g/ml CsCl-Lösung schwimmt. Halten Sie das Röhrchen mit dem Gradienten über die untere Hälfte einer Zellkulturschale (die verschüttete Materialien auffängt) und verwenden Sie eine 1-Zoll-18-G-Nadel, die an einer 3-ml-Spritze befestigt ist, um das Röhrchen direkt unter dem gebänderten Virus vorsichtig zu punktieren. Saugen Sie das Virus langsam ab, das normalerweise in ~ 1 ml wiederhergestellt wird.
   3. Entfernen Sie die Nadel aus dem Röhrchen, was dazu führt, dass das verbleibende Material im Gefälle aus dem Röhrchen in die untere Hälfte der Zellkulturschale fließt (alle Flüssigkeiten sollten als Sondermüll behandelt werden).
   4. Übertragen Sie die Viruslösung in der Spritze in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
      HINWEIS: Wenn Sie das Virus in diesem Schritt wiederherstellen, positionieren Sie die Nadel so, dass das Lumen der Nadel nach oben zeigt, wobei die Nadelöffnung einige mm unter dem virusreichen Band liegt. Vermeiden Sie eine Kontamination durch das dünne Band des unsachgemäß zusammengesetzten Virus, das manchmal 2-3 mm über dem gebänderten Virus beobachtet wird (siehe dünner schwarzer Pfeil in Abbildung 1A).
9. Entfernen Sie CsCl durch Gelfiltration aus der Probe.
   1. Eine PD-10-Säule (vorgepackt mit Sephadex G-25M), die an einen Ständer geklemmt ist, wird mit 50 ml sterilfiltriertem 0,2 μm sterilfiltriertem PBS mit 10 % (v/v) Glycerin äquilibriert.
      HINWEIS: Der anfängliche Äquilibrierungsschritt dauert 2-3 Stunden und ist notwendig, um ein vollständiges Auswaschen der Konservierungsstoffe zu gewährleisten, die vom Hersteller zur Stabilisierung der Säule verwendet werden.
   2. Lassen Sie die Waschlösung unter die Fritte (eine Schutzscheibe aus weißem Material an der Oberseite des Säulenmediums) zurücktreten, und übertragen Sie dann die in Schritt 1.8 gesammelte gereinigte Viruslösung vorsichtig auf die Oberseite der Säule. Lassen Sie die virusreiche Lösung unter die Fritte zurücktreten und beginnen Sie dann, die Säule mit PBS-Glycerin zu füllen.
      HINWEIS: Eine Funktion der Fritte besteht darin, zu verhindern, dass die Säule trocken läuft. Infolgedessen werden kurze Verzögerungen toleriert, bevor der Säule mehr Elutionsmittel zugesetzt wird.
   3. Sammeln Sie das Eluat in 12 sterilen Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 ml pro Fraktion.
10. Bestimmen Sie die Virusausbeute.
    1. Bestimmen Sie die maximalen Virusfraktionen mittels Spektrophotometrie. Bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung jeder Fraktion in PBS vor und messen Sie den OD₂₆₀ in einem Spektralphotometer, wobei eine 1:100-Verdünnung des Puffers allein als Leerwert verwendet wird. Die Viruspartikel sollten sich im Hohlraumvolumen eluieren, beginnend bei Fraktion 6. Fassen Sie die Fraktionen zusammen, die die höchsten OD_{260-Messwerte} enthalten.
    2. Nehmen Sie eine Verdünnung der gepoolten Virusfraktionen von 1:100 vor und messen Sie den OD₂₆₀ erneut. Berechnen Sie die Endkonzentration der Viruspartikel und die Anzahl der IVP in den gepoolten Fraktionen nach folgender Formel: Viruspartikel pro ml = OD₂₆₀ × 100 (dies korrigiert den Verdünnungsfaktor) × 10¹². Eine allgemeine Schätzung ist, dass 1% der Viruspartikel IVP sind, als solche: IVP/ml = OD 260 × 100 × 10^{10 oder} IVP/μL = OD₂₆₀ × 100 ×^{10 7}.
11. Aliquotieren Sie die gepoolten Virusfraktionen (die 5 x 10,⁷ bis 1 x 10,⁸ IVP enthalten) in sterile Mikrozentrifugenröhrchen oder Kryozellen. Lagern Sie die Proben bei -80 °C.

2. Transduktion der Nagetierblase

HINWEIS: Wenn Sie mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, wird empfohlen, die Anzahl der gleichzeitig übertragenen Tiere auf 2-4 zu begrenzen. Dies kann erreicht werden, indem die Startzeiten für jedes Tier gestaffelt werden, insbesondere während der Waschmittelbehandlung in Schritt 2.2 und dann der Virusinkubation in Schritt 2.3. Erfahrene Ermittler können bis zu sechs Tiere gleichzeitig transduzieren.

1. Katheterisierung der Blase
   1. Betäuben Sie weibliche C57Bl/6J-Mäuse (typischerweise 8-10 Wochen alt, ~20-25 g) oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten (typischerweise 2-3 Monate alt, ~250 g) mit einem Vaporizer mit aufgesetztem Nasenkonus. Kalibrieren Sie den Verdampfer so, dass er 3,0 % (v/v) Isofluran, 97 % (v/v) O 2 für Mäuse oder 4,0 % (v/v) Isofluran, 96 % (v/v) O₂ für Ratten erzeugt. Vergewissern Sie sich, dass die Tiere betäubt sind, indem Sie sicherstellen, dass sie nicht auf Zehenkneifen reagieren (normalerweise nach 1-2 Minuten).
   2. Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres aufrecht, indem Sie die Tiere auf ein beheiztes Pad legen. Überwachen Sie das Tier während des gesamten Transduktionsprotokolls, um sicherzustellen, dass die Tiere betäubt sind und während dieses Vorgangs keine Schmerzen verspüren.
   3. Reduzieren Sie Isofluran auf 1,5 % (v/v) bei Mäusen oder 2,0 % (v/v) bei Ratten und halten Sie die Tiere für die Dauer des Protokolls unter Narkose.
   4. Um zu verhindern, dass Luft in die Blase gelangt, füllen Sie den Kunststoffkatheterteil eines IV-Katheters (siehe Materialtabelle) und die zugehörige Nabe mit sterilem PBS mit einer Transferpipette.
   5. Tupfen Sie das Tier in Rückenlage mit 70% Alkohol ab und führen Sie den sterilen Katheter in den äußeren Meatus, dann in die Harnröhre und dann in die Blase ein.
      1. Um diese Aufgabe auszuführen, greifen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig nach dem Gewebe, das den äußeren Meatus bildet, und strecken Sie es vertikal vom Tier weg aus. Führen Sie den Katheter mit der anderen Hand vorsichtig senkrecht etwa 3-4 mm in den Harnröhrengang (ein Fleischhügel direkt über der Öffnung der Vagina) ein. Senken Sie dann aufgrund einer Biegung der Harnröhre den Katheter, der in den äußeren Meatus eingeführt wird, in Richtung des Schwanzes des Tieres, was den Eintritt in den Teil der Harnröhre, der unter dem Schambein verläuft, und schließlich in die Blase erleichtert
         . HINWEIS: Insbesondere bei der Maus kann der Katheter zu lang sein, und es sollten nicht mehr als 1,0-1,1 cm davon in das Tier eingeführt werden. Andernfalls kommt es zu einer Schädigung der Blasenschleimhaut. Um dies zu verhindern, markieren Sie den Katheter ~1 cm unterhalb seiner Spitze und führen Sie den Katheter dann nicht über diese Markierung hinaus ein.
   6. Lassen Sie den Urin in der Blase austreten. Entfernen Sie den Restharn, indem Sie das Credé-Manöver ausführen: Massieren Sie den Blasenbuckel im Unterbauchbereich ein und drücken Sie ihn sanft nach unten.
2. Machen Sie das Urothel für die Transduktion empfänglich, indem Sie es mit einer Reinigungslösung behandeln.
   1. Waschen Sie die Blase der Maus oder Ratte, indem Sie eine sterile 1-ml-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, an der Katheternabe anbringen. Injizieren Sie 100 μl steriles PBS in die Mausblase (oder 450 μl im Fall der Rattenblase). Lösen Sie die Spritze vom Katheteranschluss und lassen Sie den PBS-Abfluss zu. Führen Sie bei Bedarf das Crede-Manöver durch, um überschüssige Blasenflüssigkeit zu entfernen.
   2. 100 μl 0,1 % (w/v) N-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) (gelöst in PBS und 0,2 μm filtersterilisiert) mit einer sterilen 1-ml-Spritze in die Mausblase einträufeln. Halten Sie das DDM 10 Minuten lang in der Blase, indem Sie die Spritze an Ort und Stelle lassen. Bei Ratten ist das Volumen von DDM auf 450 μl erhöht.
   3. Entfernen Sie das DDM aus der Blase, indem Sie die Spritze abnehmen und abtropfen lassen. Führen Sie bei Bedarf das Manöver von Crede durch.
3. Führen Sie das Virus in die Blase ein.
   1. Befestigen Sie eine sterile 1-ml-Spritze an der Katheternabe und träufeln Sie 0,5 x 10⁷ bis 1 x 10⁸ IVP des Adenovirus (hergestellt in Schritt 1), verdünnt in 100 μl sterilem PBS für Mäuse oder 450 μl für Ratten, in die Blase. Lassen Sie die Spritze am Katheter befestigt, um zu verhindern, dass die Viruslösung entweicht.
   2. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Spritze ab und lassen Sie die Viruslösung die Blase auf ein Einwegkissen evakuieren. Tupfen Sie alle Restvirenlösung mit einem saugfähigen Tuch ab, entsorgen Sie das Pad und wischen Sie es in biologisch gefährlichen Abfällen.
      HINWEIS: Glycerin ist zytotoxisch. Daher ist das maximale Volumen der Viruslösung, die Mäusen eingeflößt wird, auf 5 μl begrenzt (was bei Verdünnung auf 100 μl PBS zu einer endgültigen Glycerinkonzentration von ~0,5% [v/v] führen würde). Darüber hinaus ist es möglich, die Transduktionseffizienz zu verbessern, indem die Anzahl der instillierten IVP erhöht und die Virusinkubation auf 45 Minuten verlängert wird.
   3. Optionaler Schritt: Die Blase kann mit PBS gespült werden, wie in Schritt 2.2.1 oben beschrieben; Dies ist jedoch nicht erforderlich.
4. Lassen Sie das Tier sich erholen.
   1. Stoppen Sie den Fluss von Isofluran und lassen Sie das Tier sich erholen und vollständig mobil sein, bevor Sie es in seinen Käfig zurückbringen, insbesondere wenn die Tiere in Gruppen gehalten werden.
      HINWEIS: Da die Virustransduktion an sich keine beobachtbaren Symptome oder Schmerzen der unteren Harnwege verursacht, besteht in der Regel keine Notwendigkeit für eine postoperative Behandlung. Wenn das kodierte Transgen jedoch toxisch ist, kann nach dem Eingriff eine Analgesie oder Antibiotika erforderlich sein, wie von der Einrichtung gefordert.
5. Analysieren Sie die Auswirkungen der Transgenexpression 12-72 h nach der Behandlung mit Methoden wie mRNA-in-situ-Hybridisierung, Western Blot oder Immunfluoreszenz ^9,10,23 (siehe repräsentative Ergebnisse).

Vorbereitung auf Viren
Ein Beispiel für die Virusreinigung durch Dichtegradientenzentrifugation ist in Abbildung 1A dargestellt. Das hellrosa Band, das sich an der Grenzfläche zwischen dem beladenen Zellmaterial und der 1,25 g/ml CsCl-Schicht befindet, besteht hauptsächlich aus zerrissenen Zellen und ihren Trümmern (siehe magentafarbener Pfeil in Abbildung 1A). Es leitet seine rosafarbene Farbe von der geringen Menge an Nährmedium ab, die aus Schritt 1.5 im Protokoll übernommen wird. Die interessierenden Viruspartikel, die als milchig weiße Bande erscheinen, befinden sich an der Grenzfläche der 1,25 g/ml CsCl- und 1,40 g/ml CsCl-Lösungen (siehe gelber Pfeil in Abbildung 1A). Man kann auch ein Materialband beobachten, das 2-3 mm über den angereicherten Viruspartikeln schwebt (siehe dünner schwarzer Pfeil in Abbildung 1A). Es besteht aus nicht assemblierten Viren und Ablagerungen, enthält wenig IVP und sollte bei der Entnahme der Virusprobe vermieden werden.

Die weitere Reinigung des Virus und der Pufferaustausch unter Verwendung einer PD10-Säule sind in Abbildung 1B dargestellt, und die OD_{260-Messwerte} der resultierenden Fraktionen nach der Elution sind in Abbildung 1C dargestellt. Das Hohlraumvolumen dieser Säulen beträgt ungefähr 3 ml, und daher beginnt das Virus in Fraktion 6 zu erscheinen und erreicht in Fraktion 9 seinen Höhepunkt. In diesem Experiment wurden die Fraktionen 6-9 gepoolt. Während die Fraktionen 6 und 7 relativ wenig Viruspartikel enthalten, enthalten sie genügend Viren, um eine Genesung zu verdienen, und sie dienen dazu, die sehr hohen Titerfraktionen auf eine vernünftigere Konzentration zu verdünnen. Die Fraktionen 10-12 wurden nicht einbezogen, da der Anstieg von OD₂₆₀ in Fraktion 11 auf das mögliche Vorhandensein eines zweiten kontaminierenden Peaks hinweist, der bei diesen Präparaten unterschiedlich beobachtet wird. Die gepoolte Fraktion hat typischerweise 1 x 10⁷ bis 1 x 10⁸ IVP/μl, und die erwartete Ausbeute würde in der Größenordnung von 1 x 10 10 bis 2 x^{10 11} Gesamt-IVP liegen. Dies ist eine ausreichende Menge an Viren, um Hunderte von Transduktionen durchzuführen. Während es möglich ist, das Virus durch Plaque-Assays oder durch Zählen von Zellkolonien, die fluoreszierende Proteine exprimieren, zu titrieren²², ist die 1%-Regel in den meisten Fällen ausreichend. Diese Regel besagt, dass 1% der gereinigten Viruspartikel, geschätzt durch Messung des OD₂₆₀ der Probe, IVP sind. Aliquote von Viren, die bei -80 °C gelagert werden, haben eine Haltbarkeit von 2-5 Jahren, obwohl die Infektiosität langfristig abnimmt. Aufgetaute Aliquote des Virus können bei -80 °C einmalig wieder eingefroren werden, ohne dass die Infektiosität signifikant verloren geht. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren wirkt sich jedoch negativ auf die virale Infektiosität aus.

Blasentransduktion
Ein wichtiger erster Schritt bei der Beurteilung der Auswirkungen der Transduktion ist die Bestätigung der Transgenexpression. Dies kann mit verschiedenen Techniken bewertet werden, einschließlich Werkzeugen zum Nachweis von mRNA (z. B. RNAScope), Western-Blot-Analyse oder Verwendung von Immunfluoreszenz ^9,10,23. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für ein Maus-Urothel, das mit einem Adenovirus transduziert wurde, das für das V5-Epitop kodiert, das als menschliches Wachstumshormon (V5-hGH) markiert ^ist23. Dieses Protein ist in scheibenförmige/fusiforme Vesikel verpackt und kann während der Blasenfüllung exozytiert werden^19,23. Die Western-Blot-Analyse von Urothellysaten ergab eine V5-hGH-Expression im Urothel der transduzierten Blasen, nicht jedoch in den nicht transduzierten Blasen (Abbildung 2A). Die Expression wurde auch durch Immunfluoreszenz bestätigt, in diesem Fall unter Verwendung von Antikörpern, die hGH oder das V5-Epitop-Tag erkannten (nicht transduzierte Blasen hatten kein Signal, nicht gezeigt) (Abbildung 2B).

Ein weiteres Beispiel ist die Transduktion der Rattenblase mit einem Virus, das für CLDN2 kodiert, ein porenbildendes Tight-Junction-assoziiertes Protein^24,25. CLDN2 erhöht den parazellulären Fluss von Kationen (einschließlich K⁺) und seine Überexpression führt zu Entzündungen und der Entwicklung viszeraler Schmerzen¹⁰. Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Expression von CLND2 in Rattenblasen, die mit Cldn2-kodierendem Adenovirus transduziert wurden, aber nicht in solchen, die mit einem GFP-kodierenden Kontrollvirus transduziert wurden (Abbildung 2C). Im Allgemeinen wird GFP nicht als toxisch angesehen, wenn es in Zellen exprimiert wird, und dient daher als nützliche Kontrolle. Die Verwendung von GFP ermöglicht es dem Untersucher auch, zu bestätigen, dass die Transduktion funktioniert. Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigte außerdem die exogene CLDN2-Expression in Urothel-Regenschirmzellen, die mit dem Virus transduziert wurden, das für Cldn2-cDNA kodiert (rotes Signal in Abbildung 2D). Darüber hinaus ist das exprimierte CLDN2, ähnlich wie beim endogenen CLDN2 (nicht gezeigt), an TJP1-markierten Tight Junctions sowie an den basolateralen Oberflächen der Regenschirmzellen lokalisiert (CLDN2 ist in Abbildung 2E grün markiert)¹⁰. Im Fall der CLDN2-Expression war sie einen Tag nach der Transduktion am höchsten, ließ dann aber nach und war nach 15 Tagen kaum noch nachweisbar.

Eine zweite Überlegung ist, welche Zelltypen von der adenoviralen Transduktion angegriffen werden. Während es bei Ratten möglich ist, die Regenschirmzellschicht¹⁹ größtenteils zu transduzieren, können bei Mäusen alle Schichten des Urothels transduziert werden, obwohl die Transduktion der Zwischen- und Basalzellschichten variabel sein kann. Wichtig ist, dass in der gesamten Blasenwand nur das Urothel transduziert wird und kein anderes Gewebe vom eingeträufelten Adenovirus angegriffen wird (Abbildung 3).

Während Analysen von transduzierten Zellen auf Einzelzellebene durchgeführt werden können, muss bei der Untersuchung eines Gesamtblasenphänotyps die Mehrheit der Urothelzellen transduziert werden. Daher ist es wichtig, die Effizienz der Transduktion zu definieren (d.h. welcher Anteil der Urothelzellen transduziert wird). Im Fall des Cldn2-exprimierenden Adenovirus wurden beispielsweise >95% der Umbrella-Zellen transduziert (siehe Abbildung 2D). Ein weiteres Beispiel ist das in Abbildung 3 gezeigte Bildfeld, in dem die Zählung der Anzahl der transduzierten Regenschirmzellen (in diesem Fall die Expression des Ca²⁺ -Sensors GCAMP5G) einen Wirkungsgrad von fast 95 % zeigt. Man muss jedoch Zellen in zufälligen Feldern untersuchen, die in der gesamten Blasenwand entnommen werden, um eine genaue und unvoreingenommene Schätzung der Transduktionseffizienz zu erhalten.

Abbildung 1: Aufreinigung des Adenovirus. (A) Adenovirus-Partikel, die von infizierten HEK293T-Zellen produziert wurden, wurden durch Zentrifugation auf einem diskontinuierlichen CsCl-Gradienten gereinigt, der aus einer Schicht von 1,4 g/ml CsCl, einer Schicht von 1,25 g/ml CsCl und einer in Tris-EDTA-Lösung verdünnten Schicht der Probe (S) bestand. Das Zellmaterial (rosa Pfeil) sammelt sich an der S/1.25-Grenzfläche an, während das gereinigte Adenovirus an der 1.25/1.4-Grenzfläche schwebt (gelber Pfeil). Über letzterem schwebt ein kleines Band falsch zusammengesetzter Viren (dünner schwarzer Pfeil). (B) Die Adenovirus-reiche Bande im Gradienten wird unter Verwendung einer Nadel gewonnen, und das CsCl wird durch Gelfiltration unter Verwendung einer mit G25-Sephadex gefüllten PD10-Säule, die mit PBS mit 10,0% (v/v) Glycerin äquilibriert ist, aus dem Adenovirus entfernt. Die Oberfläche des Sephadex ist durch eine poröse Kunststofffritte geschützt. (C) Fraktionen, 0,5 ml, wurden aus der PD10-Säule gesammelt. Die OD₂₆₀ der Fraktionen wurden in einem Spektralphotometer gemessen und die Werte aufgetragen. Virusreiche Fraktionen eluieren im Hohlraumvolumen, das bei Fraktion 6 beginnt und sich bis zur Fraktion 9 erstreckt. Gepoolte Brüche für dieses repräsentative Experiment sind blau schattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Transduktion von Nagetierblasen-Urothel mit Adenoviren, die für V5-hGH oder CLDN2 kodieren. (A) Maus-Urothel wurde nicht transduziert (UT) oder mit Adenoviren transduziert, die für das V5-Epitop kodieren, das mit menschlichem Wachstumshormon (hGH) markiert ist. Nach 24 h wurden die Blasen geborgen, Urothellysate wurden hergestellt und einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, und die V5-hGH-Expression wurde unter Verwendung von Western Blots bestätigt, die mit einem Antikörper gegen hGH untersucht wurden. (B) Nachweis von V5-hGH in Maus-Urothel, das unter Verwendung von Antikörpern gegen hGH (grün) oder das V5-Epitop (rot) und Fluorophor-markierte Sekundärantikörper geschnitten und gefärbt wurde. Die Immunfluoreszenz wurde mittels konfokaler Mikroskopie erfasst. Die Proben wurden mit TO-PRO3 gegengefärbt, um die Kerne zu markieren. (C-F) Ratten-Urothel wurde mit einem Virus transduziert, das für Ratte CLDN2 (gebräuchlicher Name Claudin-2) oder GFP (gebräuchlicher Name grün fluoreszierendes Protein) als Kontrolle kodiert. (C) Nachweis von exogenem CLDN2 durch Western Blot unter Verwendung eines Antikörpers gegen CLDN2. Beachten Sie, dass das endogene CLDN2 in niedrigen Konzentrationen exprimiert wird und in diesem Experiment nicht nachgewiesen wird. (D) Die Transduktion der Schirmzellschicht wird durch Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie aufgedeckt. Die Grenzen der Zelle werden durch Co-Färbung des Gewebes mit FITC-Phalloidin aufgedeckt, das das kortikale Aktin-Zytoskelett markiert. (E) Nachweis von exogenem CLDN2 und TJP1 (gebräuchlicher Name ZO1) durch Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie von ganzmontiertem oder querschnittsartigem Urothel. Kleine weiße Pfeile zeigen die Position des Tight Junction an und kleine magentafarbene Pfeilspitzen markieren die Position der intrazellulären Ansammlungen von CLDN2 im Zellzytoplasma. Es wurde zuvor festgestellt, dass es sich dabei um Golgi-assoziiertes CLDN2¹⁰ handelt. (F) Nach der Transduktion wurden die Tiere an den angegebenen Tagen nach der Infektion eingeschläfert. Die exogene CLDN2-Expression wurde mittels Western Blot nachgewiesen. Tiere, die GFP exprimierten, wurden nach Tag 1 eingeschläfert. Die Daten in Abbildung 2C-E wurden von Montalbetti et ^al.10 modifiziert und werden mit Genehmigung der American Physiological Society reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Effizienz der adenoviralen Transduktion. Das Blasen-Urothel der Maus wurde mit einem Adenovirus transduziert, das für den Kalziumsensor GCaMP5G kodiert. Die oberen Tafeln zeigen die Färbung für GCaMP5G (nachgewiesen mit einem Antikörper gegen grün fluoreszierendes Protein; GFP, grün), zeigen die mittleren Tafeln die Verteilung von DAPI-gefärbten Kernen (blau) und Rhodamin-Phalloidin-markiertem Aktin (rot), und die unteren Tafeln sind eine Verschmelzung der drei Signale. Die weißen Pfeilspitzen in der unteren Tafel sind die seltenen Schirmzellen, die nicht transduziert werden. Die Gesamteffizienz der Transduktion von Regenschirmzellen in diesem Bild beträgt ~95%. Beachten Sie, dass nur das Urothel transduziert wird. Die eingerahmten Bereiche werden in den Bedienfeldern auf der rechten Seite vergrößert. Die Region in Box 1 besteht hauptsächlich aus transduzierten Schirmzellen. Die Region in Kasten 2 ist ein Urothel, das eine effiziente Transduktion von Umbrella-Zellen, aber eine weniger effiziente Transduktion der darunter liegenden Zellschichten zeigt. LP = lamina propria; ME = muscularis externa; Se = serosa; Ut = Urothel. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen (siehe Materialtabelle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Während sich Ramesh et al. auf die Entwicklung von Strategien zur Verwendung der adenoviralen Transduktion bei der Behandlung von Blasenkrebs konzentrierten 18, haben neuere Berichte den Nutzen dieser Techniken bei der Untersuchung der normalen Urothelbiologie/-physiologie und Pathophysiologie gezeigt 10,18,19,20,21 . Zu den wichtigen Merkmalen dieses Ansatzes gehören die folgenden: (i) In der gesamten Blasenwand des Nagetiers wird nur das Urothel transduziert 10,19,20,21,22. Bei Ratten ist die Transduktion meist auf die Schirmzellschicht beschränkt, während bei Mäusen das gesamte Urothel angegriffen werden kann; (ii) Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Proteine oder siRNAs zu exprimieren 10,19,20,21,22; (iii) Die Effizienz der Transduktion kann sich 70 % bis 95 % nähern (siehe z. B. Abbildung 3)^18,20; (iv) Einen Tag nach der Transduktion sind die Ultrastruktur des Urothels, die Integrität des Gewebes, das Vorhandensein einer hochohmigen Barriere (beurteilt durch Messung des transepithelialen Widerstands) und die Expression von Urotheldifferenzierungsmarkern "normal"^10,19. Der einzige morphologische Effekt, der bisher festgestellt wurde, ist eine Abnahme des Schirmzelldurchmessers (von oben betrachtet); Sie kehren jedoch nach 3-4 Tagen zu ihrer normalen Größe zurück^10,19; (v) Das Urothel kann mit bis zu drei verschiedenen Adenoviren gleichzeitig transduziert werden¹⁸; (vi) Die Transgenexpression kann durch Titration der Anzahl von IVP, die sich auf die Menge der Proteinexpression auswirkt, durch Verlängerung oder Verkürzung der Inkubationszeit vor dem Töten des Tieres oder durch Verwendung verschiedener Promotoren, wie z. B. eines tet-regulierten Systems (tet-off), verändert ^werden19. Im letzteren Fall kann man ein Virus, das für den Transaktivator/Tet-Repressor kodiert, co-exprimieren und dann die Expression des Transgens modulieren, indem man die Konzentration von Doxycyclin in der Nahrung des Tieres verändert.

Während das Gesamtprotokoll relativ einfach ist, gibt es einige kritische Schritte, die bei der Durchführung dieser Experimente berücksichtigt werden müssen. Eine davon ist die Verfügbarkeit von Virusbeständen mit hohem Titer, die von angemessener Reinheit sind. Adenoviren können von kommerziellen Anbietern, von institutionellen Virusproduktionskernen, von anderen Forschern bezogen oder im eigenen Haus hergestellt werden. Im letzteren Fall wird das AdEasy-System des Bert-Vogelstein-Labors empfohlen, da seine Komponenten von Addgene bezogen werden können und Adenoviren, die mit diesem Ansatz erzeugt werden, bei der Urotheltransduktion⁴ gut funktionieren. Diese Technik ermöglicht es, Adenoviren zu erzeugen, die für cDNAs mit einer Größe von bis zu 8 Kb kodieren, indem man das pAdEasy-1-Verpackungsplasmid (das Insert ersetzt die viralen Gene E1 und E3), die pAdEasier-1-Bakterienzellen (die für die Produktion von Viren notwendige adenovirale Gene kodieren) und die Produktion von replikationsdefekten Adenoviren in HEK293T-Zellen (die das erforderliche virale E1-Protein exprimieren) verwendet. Die Substitution des pAdEasy-1-Verpackungsplasmids durch das pAdEasy-2-Verpackungsplasmid erhöht die Verpackungsgröße jedoch um weitere 2,7 kB, erfordert jedoch die Verwendung einer anderen Zelllinie (E1-transformierte humane embryonale retinale 911-Zellen), da den Viren neben E1 und E3⁴ auch das frühe Gen E4 fehlt. Die Expression von siRNAs kann mit verschiedenen Systemen erreicht werden, einschließlich pAdloss, das in Kasahara et ^al.26 ausführlich beschrieben wird. Während es möglich sein kann, virusreiches Zellkulturmedium zu verwenden, um das Urothel zu transduzieren, kann diese Methode unzuverlässig sein. Stattdessen bietet die groß angelegte Virusamplifikation, die CsCl-Gradientenreinigung, gefolgt von der Gelfiltration, den zuverlässigsten Weg, um große Mengen von Viren mit hohem Titer zu erzeugen. Die relative Stabilität des Virus bei -80 °C, gepaart mit relativ hohen Virusausbeuten, macht dies zu einem idealen Weg, um einen konsistenten Virusbestand zu haben, der über eine große Anzahl von Experimenten verwendet werden kann.

Weitere kritische Schritte in diesem Protokoll sind diejenigen, die mit dem Transduktionsprotokoll verbunden sind. Dazu gehören die Verwendung von PBS (ohne zweiwertige Kationen) als Wasch- und Verdünnungsmittel sowie die Verwendung von DDM-Waschmittel. Da der Junctional-Komplex für eine ordnungsgemäße Funktion von Ca²⁺ abhängig ist, fördert PBS wahrscheinlich den Viruseintritt, indem es die Junction-assoziierte Barriere stört. DDM ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Wie Ramesh et al. berichteten, ist die Effizienz der Adenovirus-Transduktion ohne Detergenzienbehandlung äußerst gering¹⁸. Die Wirkungsweise des Waschmittels ist jedoch nicht klar. Ideal ist eine 10-minütige Inkubation mit DDM, die jedoch auf 5 min verkürzt werden kann. Es wird jedoch nicht empfohlen, dass die Inkubation länger als 10 Minuten dauert, da das Reinigungsmittel unerwartete Schäden am darunter liegenden Gewebe verursachen kann. Die Menge des verwendeten Virus ist ein kritischer Parameter, wobei höhere Konzentrationen im Allgemeinen zu einer größeren Transgenexpression und einer höheren Transduktionseffizienz führen. Die optimale Viruskonzentration, die die beste Kombination aus Expression, Effizienz und Phänotyp ergibt, muss jedoch empirisch bestimmt werden. Als Ausgangskonzentration wird ein Bereich von 5,0 x 10⁶ bis 2,0 x 10⁷ IVP pro Tier empfohlen. Je nachdem, welches Protein exprimiert wird, ergeben sich Wirkungsgrade im Bereich von 70%-95% 10,19,20,21,22; Einige dominant-negative GTPase-Konstrukte sind jedoch weniger effizient (30%-50%) und erfordern einen Einzelzellanalyseansatz ^4,20. Diese Unterschiede in der Effizienz können den Umsatz des Transgens, seine Toxizität oder die Reinheit und Ausbeute des für die Transduktion verwendeten Virus widerspiegeln. Letzteres kann durch die Durchführung von Plaque-Assays ausgeschlossen werden. Obwohl es nicht überkritisch ist, muss die Zeit, die das Virus in der Blase verbleibt, lang genug sein, damit sich das Virus an seinen CXADR-Rezeptor anheften kann. Zeiten von weniger als 30 Minuten können die Effizienz der Transduktion verringern, während eine Verlängerung der Inkubationszeit auf 45 Minuten die Effizienz erhöhen kann. Dies kann jedoch transgenabhängig sein. Der letzte kritische Schritt in diesem Protokoll besteht darin, zu bestimmen, wie lange das Tier gehalten wird, bevor ein Phänotyp beurteilt wird. Transgene zeigen die höchste Expression nach 1-2 Tagen¹⁹, aber die Expression kann danach abnehmen. Im Fall von siRNAs hängt es von der Umsatzrate des Proteins selbst ab. Bei der Expression von siRNAs, die auf die Expression von Rab11a, einer GTPase der Rab-Familie, abzielen, wird beispielsweise erst 72 h nach der Transduktion eine effiziente Herunterregulierung beobachtet²³. Daher sind langlebige Proteine (mit Halbwertszeiten gemessen in Tagen) möglicherweise keine geeigneten Ziele für diesen Ansatz.

Der Ermittler sollte sich auch der mit diesem Ansatz verbundenen Vorbehalte bewusst sein. Erstens kann sein Nutzen auf weibliche Nagetiere beschränkt sein, da es schwierig ist, männliche Nagetiere durch ihren Penis zu katheterisieren. Es kann jedoch technisch möglich sein, dieses Protokoll bei Männern durchzuführen, indem ein Katheter in die Blasenkuppel eingeführt wird, ähnlich dem Präparat, das bei der Durchführung der Zystometrie^{verwendet wird 9}. Dies würde es ermöglichen, ein Waschmittel oder einen Virus einzuführen und bei Bedarf Wäschen durchzuführen. Ein zweiter Vorbehalt ist, dass die Überexpression von Proteinen Zellwege und -ressourcen erschöpfen kann, was zu Ereignissen wie Proteinaggregation, Aktivierung von Zellstresswegen und Tod führen kann²⁷. Daher ist es im Allgemeinen ratsam, die Transgenexpression auf nicht-toxische Werte zu beschränken (es sei denn, dies ist natürlich die Absicht der Transgenexpression), wie anhand von Markern für Zellstress und Zelltod bewertet. Ein dritter Vorbehalt ist, dass in einigen Situationen eine langfristige Adenovirus-Expression Immunreaktionen auslösen kann²⁸. Es gibt zwar keine Hinweise darauf, dass die adenovirale Transduktion des Urothels an sich die Immunantwort stimuliert¹⁰, dies ist transgenabhängig und wie oben erwähnt, führt die Überexpression von CLDN2 zu einer Blasenentzündung.

Gegenwärtig verfügen die Forscher über eine Vielzahl von Methoden, mit denen sie die Gen- und Proteinexpression im Urothel modulieren können, einschließlich der Verwendung von transgenen oder bedingten Urothel-Knockout-Mäusen, der Verwendung von Transfektionsreagenzien oder der Verwendung von adenoviraler Transduktion. Die letztere Methode, Gegenstand dieses Protokolls, ist relativ einfach, effizient und reproduzierbar. Abgesehen von den anfänglichen Kosten für Zellkulturreagenzien, die zur Erzeugung der Virusvorräte benötigt werden, führt die sehr große Menge des produzierten Virus (genug, um Hunderte von Transduktionen durchzuführen) zu relativ niedrigen Kosten pro Tier. Die adenovirale Transduktion kann zur Untersuchung der Urothelbiologie genutzt werden. Zum Beispiel wurde die adenovirale Transduktion verwendet, um die Bedeutung von GTPasen der Rho-Familie und der Rab-Familie, Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, Myosin-Motorfragmenten und ADAM17 bei Exozytose und Endozytose zu definieren 10,19,20,21,22, und die adenovirale Transduktion wurde kürzlich verwendet, um die urotheliale Mechanotransduktion ^zu untersuchen⁹ . Ebenso kann die adenovirale Transduktion bei der Erforschung und Behandlung menschlicher Krankheiten relevant sein. Zum Beispiel schlugen Ramesh et al. ursprünglich vor, dass die adenovirale Transduktion ein nützlicher Weg sein könnte, um Tumorzellen anzusprechen¹⁸. Während ihre Studien eher ein Proof-of-Principle-Ansatz waren, kann man sich vorstellen, dass die Expression von Toxinen in Krebszellen oder die Expression von Epitopen, die vom Immunsystem erkannt werden könnten, nützliche Strategien wären. Die adenovirale Transduktion kann auch nützlich sein, um Krankheiten zu verstehen, bei denen eine Über- oder Unterexpression von Genprodukten zu einer Krankheit führt. So zeigen beispielsweise Biopsien aus den Blasen von Patienten mit interstitieller Zystitis eine 90-fache Erhöhung der CLDN2-Expression ²⁹. Interessanterweise repliziert die Überexpression von CLDN2 unter Verwendung der adenoviralen Transduktion viele der Symptome dieser Krankheit bei Ratten¹⁰. Daher könnte CLDN2 ein Ziel bei der Behandlung von Patienten mit dieser Störung sein.