GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
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1<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> <strong>VON</strong> <strong>PROTEINEN</strong><br />
1. KURZBESCHREIBUNG DER ÜBUNG<br />
1.1 ZIEL DER ÜBUNG<br />
Molekulargewichtsbestimmung biologischer Analyten nach Separation unter Verwendung<br />
einer Kalibrierfunktion, welche mittels Markerproteinen erstellt wird.<br />
1.2 EINGESETZTE ANALYSENTECHNIK<br />
SDS-Gelelektrophorese (SDS = sodium dodecylsulfate) mit selbst angefertigten, isokratischen<br />
Polyacrylamid-Gelen (PAG). Entwicklung auf einer Hoefer SE 250 Mini-Vertikal-<br />
Gelelektrophoreseeinheit zur raschen Elektrophorese von Protein- oder Nukleinsäure-Proben<br />
geringen Volumens.<br />
2. PRINZIP DER POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE <strong>VON</strong><br />
PROTEIN-SDS KOMPLEXEN (SDS-PAGE)<br />
In freier Lösung wandern ionische Verbindungen elektrophoretisch (im elektrischen Feld)<br />
entsprechend ihrer Ionenbeweglichkeit, welche von ihrer Größe, Ladung und Form abhängt.<br />
‐‐ ‐ ‐‐ ‐‐ ‐ ‐<br />
‐‐ ‐ ‐‐ ‐<br />
‐‐ ‐‐ ‐ ‐ ‐ ‐‐ ‐ ‐ ‐<br />
‐ ‐‐ ‐ ‐ ‐<br />
Puffer<br />
Substanzgemisch<br />
Substanz 1<br />
Substanz 2<br />
‐<br />
Kathode<br />
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐<br />
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐<br />
‐‐ ‐ ‐‐ ‐‐ ‐ ‐‐<br />
‐‐ ‐ ‐‐ ‐ ‐‐ ‐‐<br />
Anode<br />
Abb 1: Separation im elektrischen<br />
Feld in freier Lösung<br />
+<br />
Im elektrischen Feld wirkt auf die Ladung q eines Teilchen die beschleunigende Kraft<br />
F e:<br />
F e = q * E mit q = z * e<br />
E .. Elektr. Feldstärke, z .. Ladungszahl, e .. Elementarladun)<br />
Ebenso aber auch die Reibungskraft F fr:<br />
F fr = f c * v<br />
v .. Wanderungsgeschw. d. Teilchens, f c .. Reibungskoeffizient<br />
f c .. abh. von Viskosität d. Mediums od. Porosität d. Matrix<br />
Gleichgewicht d. Kräfte bewirkt konst. Geschw. im elektr. Feld :<br />
F e = F tc; q * E = f c * v<br />
� v = (q * E) / f c = u * E<br />
u .. Mobilität = Proportionalitätsfaktor zw. Feldstärke E und<br />
Wanderungsgeschwindigkeit<br />
Gültigkeit des Stokes‘schen Gesetesz für kleine, kugelförmige Teilchen:<br />
u = q / f c = (z * e)/(6π * η * r)<br />
Nichtkugelförmige Teilchen (Peptide, Proteine):<br />
u ∞ q / M 2/3<br />
® Martina Marchetti, TU Wien, Chemische Technologien und Analytik
2<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
Biopolymere wie Proteine werden demnach in freier Lösung ebenfalls nach Größe und<br />
Ladung getrennt, wobei letztere vom pH des Trennpuffers (relativ zum pI des Proteins)<br />
bestimmt wird. Um Proteine nach ihrer Größe zu trennen, verwendet man eine Matrix (mit<br />
einer permanenten oder temporären Porenstruktur), welche die Analyten entsprechend ihrer<br />
Größe retardieren soll. Als solche wird in der Gelelektrophorese, wie der Name sagt, ein Gel,<br />
z.B. aus Polyacrylamid verwendet 1 .<br />
H 2C<br />
CH<br />
C O<br />
NH 2<br />
H 2C<br />
+<br />
H 2C<br />
CH<br />
C O<br />
NH<br />
CH 2<br />
NH<br />
C O<br />
CH<br />
H 2<br />
C CH<br />
H 2<br />
C<br />
H 2<br />
C<br />
H 2C<br />
C O<br />
NH 2<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH 2<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH<br />
H 2C<br />
NH<br />
C O<br />
C<br />
H 2<br />
C<br />
H 2<br />
C<br />
H 2<br />
C CH H 2C<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH 2<br />
H<br />
C<br />
H 2C<br />
H 2C<br />
C O<br />
NH 2<br />
H<br />
C<br />
H 2C<br />
C O<br />
NH 2<br />
Abb. 2: Polyacrylamidgel<br />
Die Verwendung einer solchen „siebenden“ Matrix reicht aber offensichtlich nicht aus, um<br />
die Analytionen allein entsprechend ihrer Größe zu retardieren, da große Moleküle mit hoher<br />
Ladungszahl schneller wandern können als kleine Moleküle mit geringer Ladung. Um eine<br />
Trennung ausschließlich entsprechend der Größe zu erhalten, müssen die Ladungsdifferenzen<br />
der nativen Proteine eliminiert werden, besser gesagt ihre unterschiedlichen Verhältnisse von<br />
Ladung zu Größe. Alle Proteine sollten daher dieselbe Mobilität (in freier Lösung) besitzen.<br />
Dazu lässt man die Proteine mit Na-dodecylsulfat (SDS) reagieren. SDS ist ein<br />
Tensid, und besitzt eine lipophile Alkylgruppe (C12) und einen hydrophilen, anionischen<br />
Sulfatrest. Man belegt nun die Proteinoberfläche mit den lipophilen C12-Ketten (dies<br />
geschieht vorwiegend bei erhöhter Temperatur). Umso größer das Protein ist, desto mehr<br />
SDS-Moleküle binden an seiner Oberfläche (etwa 1.4g SDS/g Protein). Die ursprüngliche<br />
Proteinladung wird dabei maskiert. Da jedes bindende SDS-Molekül mit seiner Sulfat-Gruppe<br />
jeweils eine negative Ladung beisteuert, sind die entstehenden Protein-SDS-Komplexe umso<br />
stärker negativ geladen, je mehr SDS am Protein angelagert ist. Da die Anzahl der<br />
angelagerten SDS-Ketten hauptsächlich (wenn auch nicht ausschließlich) von der<br />
Proteingröße abhängt, entstehen Komplexe mit demselben Ladung-zu-Masse-Verhältnis, d.h.<br />
mit derselben Mobilität (in freier Lösung). Ohne Siebmedium würden die Komplexe<br />
tatsächlich mit derselben Geschwindigkeit im elektrischen Feld wandern. In der Siebmatrix<br />
hingegen wandern sie entsprechend ihrer Größe, und nicht beeinflusst durch die native<br />
1<br />
Man beachte, dass dieser Matrix eine Elektrolytlösung beigefügt ist, welche den pH-Wert vorgibt und im wesentlichen für den elektrischen<br />
Stromtransport verantwortlich ist.<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH<br />
CH 2<br />
NH<br />
C O<br />
C<br />
CH<br />
H 2<br />
C<br />
H 2C<br />
H 2C<br />
H<br />
C<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH 2<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH 2<br />
C O<br />
NH 2<br />
H 2C<br />
H 2<br />
C<br />
H 2<br />
C<br />
CH<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH 2<br />
H<br />
C<br />
C O<br />
NH 2<br />
C O<br />
NH 2<br />
H 2C<br />
H 2C<br />
® Martina Marchetti, TU Wien, Chemische Technologien und Analytik<br />
CH<br />
C O<br />
NH<br />
CH 2<br />
NH<br />
C O<br />
C<br />
H 2<br />
C CH H 2C CH<br />
C O<br />
NH 2
3<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
Ladung der Proteine. Darauf beruht das Prinzip der größenspezifischen Trennung in der SDS-<br />
PAGE.<br />
‐<br />
‐ ‐ ‐<br />
‐<br />
‐ ‐ ‐<br />
‐<br />
‐<br />
‐ ‐ ‐<br />
‐<br />
‐ ‐<br />
‐ ‐ ‐<br />
‐ ‐<br />
‐<br />
‐ ‐ ‐ ‐<br />
‐<br />
‐<br />
‐ ‐<br />
‐<br />
‐ ‐<br />
‐<br />
Abb 3: Denaturierung eines Proteins durch SDS<br />
Damit die Trennung nur nach dem Molekulargewicht erfolgt und nicht durch räumliche<br />
Strukturen des Proteins beeinflusst wird, müssen auch vorhandene Disulfidbrücken reduziert<br />
werden:<br />
HS<br />
Pro t e in S S P ro t e in + 2<br />
OH<br />
Mercaptoethanol<br />
Abb 4: Reduktion vorhandener Disulfidbrücken durch Mercaptoethanol<br />
Bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese wird in einem weitporigen Sammelgel<br />
zwischen Cl - Ionen hoher Mobilität und Glycin Ionen geringerer Mobilität die Probe<br />
aufgetragen. Im elektrischen Feld wird während der Ionenbewegung ein Probe-Ionen-Stapel<br />
erzeugt (Isotachophoretischer Effekt), der sich mit Erreichen der Kante des Trenngels auflöst<br />
und eine Zonenelektrophorese mit scharfen Probezonen anschließt.<br />
Abb 4: Zonenelektrophorese und Zusammenhang Wanderungsstrecke/logMW<br />
Experimentell wurde gefunden, dass ein weitgehend linearer Zusammenhang besteht<br />
zwischen dem Logarithmus der molekularen Masse (log MW) und der relativen<br />
Wanderungsstrecke (Rf) der Separanden 2 . Dieser Zusammenhang lässt sich als einfache<br />
Kalibrierfunktion nutzen. Die Ermittlung der Molekülmasse eines Proteins mittels SDS-<br />
PAGE erfolgt also durch Bestimmung der Wanderungsstrecke des betreffenden Proteins in<br />
einem Gel und dem Vergleich dieser Strecke mit den Wanderungsstrecken von<br />
Referenzproteinen bekannter Molekülmasse.<br />
2<br />
Der Rf-Wert ist wie in der Dünnschichtchromatographie definiert: als Wanderungsstrecke des Analyten relativ zur Wanderungsstrecke<br />
einer nicht-retardierten Substanz (Frontmarker-Farbstoff).<br />
2<br />
® Martina Marchetti, TU Wien, Chemische Technologien und Analytik<br />
‐<br />
‐<br />
Pro te in S H<br />
+<br />
HO OH<br />
S S
3. ARBEITSANLEITUNG<br />
3.1 REAGENZIEN<br />
4<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
Acrylamid-/Bisacrylamidmonomerlösung: 30%T, 2.7% C<br />
Trenngelpuffer: 1.5M Tris-Cl, pH 8.8<br />
Sammelgelpuffer: 0.5M Tris-Cl, pH 6.8<br />
10%-ige SDS Lösung<br />
TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylenamin)<br />
10%-ige Ammoniumpersulfat<br />
Denaturierungsmix (red. Bedingungen): 0.125M Tris-Cl, pH=6.8, 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-<br />
Mercaptoethanol, 1% Bromphenolblau<br />
Elektrophoresepuffer nach Verdünnung: 0.025M Tris, 0.192M Glycin, 0.1% SDS, pH=8.3<br />
Färbelösung: 0.025% Coomassie Blau R-250, 40% Methanol, 7% Essigsäure<br />
Entfärbelösung I: 7% Essigsäure, 40% Methanol<br />
Entfärbelösung II: 7% Essigsäure, 5% Methanol<br />
3.1 GIEßEN <strong>VON</strong> ZWEI ISOKRATISCHEN GELEN IN EINER GELGIEßKAMMER<br />
Plastikblock<br />
Anpressschiene<br />
Abb 5: Gelgießkammer<br />
Gummidichtung<br />
Gelsandwichhalterung<br />
Castingbehälter<br />
Feststell-<br />
Schrauben<br />
1. Zerlegen Sie die Gelgießkammer (Abb. 5) und reinigen Sie diese gründlich mit<br />
Leitungswasser.<br />
Entfernen Sie dafür zunächst die schwarzen Feststellschrauben an der Seite des<br />
Castingbehälters und ziehen danach vorsichtig die Gelsandwichhalterungen heraus.<br />
ACHTUNG:<br />
Keine organischen Lösungsmittel, Säuren oder Basen zum Reinigen der<br />
Kammerteile verwenden!<br />
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<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
2. Lockern Sie die Schrauben der Anpressschienen an der Gelsandwichhalterung und stellen<br />
Sie diese auf eine waagrechte, ebene Oberfläche (Fliesen). Schieben Sie die<br />
Anpressschienen weg vom Plastikblock.<br />
3. Ein Gelsandwich besteht aus einer Aluminiumoxidplatte, zwei Abstandhaltern und einer<br />
Glasplatte (Abb. 6). Nachdem Sie die Aluminiumplatte auf die Arbeitsoberfläche gelegt<br />
haben, positionieren Sie die Abstandhalter links und rechts an der Platte und passen die<br />
Glasplatten oben darauf an. Die lange flache Seite des T-förmigen Abstandhalters passt<br />
genau zwischen die Glasplatte und die Aluminiumplatte.<br />
Um einen geraden Abschluss an der Unterkante des Gelsandwiches zu erhalten, stellen Sie<br />
diesen vertikal auf die gerade Oberfläche des Arbeitsplatzes.<br />
Kamm<br />
Abstandhalter<br />
Abb 6: Gelsandwich mit Kamm<br />
Glasplatte<br />
Aluminiumoxidplatte<br />
4. Schieben Sie den Gelsandwich nun vorsichtig zwischen dem Plastikblock und der<br />
Anpressschiene in die aufrecht stehende Gelsandwichhalterung. Dabei soll die<br />
Aluminiumoxidplatte zum Plastikblock weisen und der Gelsandwich bündig mit der<br />
Arbeitsoberfläche abschließen.<br />
5. Während Sie das Gelsandwich in der Gelsandwichhalterung festhalten, ziehen Sie die<br />
Anpressschrauben fest.<br />
ACHTUNG:<br />
NICHT ZU FEST, DA SONST DIE GLAS-/ALUMINIUMPLATTEN BRECHEN !<br />
MAXIMAL FINGERFEST ZUDREHEN !<br />
6. Kontrollieren Sie Ihren Aufbau, um Undichtheiten zu vermeiden. Die Platten und die<br />
Abstandhalter müssen gerade abschließen. (Überprüfung durch Einfüllen von Wasser,<br />
Wasserspiegel darf nicht absinken)<br />
7. Setzen Sie nun die Gelsandwichhalterungen der Reihe nach in den Castingbehälter ein.<br />
Die Aluminiumplatte soll dabei hinten sein.<br />
® Martina Marchetti, TU Wien, Chemische Technologien und Analytik
6<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
8. Setzen Sie die Feststellschrauben am Castingbehälter so ein, dass das kurze Ende nach<br />
oben weist. Zurren Sie die Gelsandwichhalterungen fest, in dem Sie die Feststellschrauben<br />
180° verdrehen, sodass das kurze Ende nach unten weist.<br />
9. Stellen Sie nun die Lösungen nach dem in Tabelle 1 aufgelisteten Pipettierschema her.<br />
Zuerst ist das Trenngel herzustellen.<br />
ACHTUNG: HANDSCHUHE TRAGEN ! ACRYLAMID IST NEUROTOXISCH!<br />
Schritte Trenngel Sammelgel<br />
1 Acrylamid-/Bisacrylamidmonomerlösung<br />
(30% T, 2,7% C) 1<br />
6,65 ml 0,67 ml<br />
2 Trenngelpuffer (1,5M Tris-Cl, pH=8,8) 5,00 ml -<br />
3 Sammelgelpuffer (0,5M Tris-Cl, pH=6,8) - 1,25 ml<br />
4 10% SDS (Sodiumdodecylsulfat) 0,20 ml 50 µl<br />
5 deionisiertes Wasser 8,05 ml 3,0 ml<br />
6 Lösung im Ultraschallbad 5 min entgasen 4<br />
7 10%ige Ammoniumpersulfat-Lösung 2 100 µl 25 µl<br />
8 TEMED 3 6,65 µl 2,5 µl<br />
Endvolumen 20 ml 5ml<br />
Lösung im Ultraschallbad 1 min entgasen 4<br />
Tab. 1: Pipettierschema für Sammelgel und Trenngel.<br />
1 g(<br />
Acrylamid + Bisacrylamid)<br />
g(<br />
Bisacrylamid)<br />
% T = . 100 % C =<br />
. 100<br />
100 ml<br />
g(<br />
Acrylamid + Bisacrylamid)<br />
2 Die Ammoniumpersulfat-Lösung dient als Radikalstarter für die radikalische Polymerisation.<br />
Die Lösung muss frisch hergestellt werden: Dazu werden die im Eppendorfgefäß eingewogenen<br />
20 mg in 200 µl Wasser gelöst.<br />
3 TEMED dient als Katalysator.<br />
4<br />
Die Lösungen für das Trenngel und das Sammelgel sind zu entgasen, da Sauerstoff die<br />
Polymerisation stört.<br />
10. Die nach dem Pipettierschema hergestellte Trenngellösung wird mit einer Einwegpipette<br />
etwa 6 cm hoch in die Sandwiches gefüllt. Die Lösung wird am besten von einem Eck des<br />
Gelsandwiches ausgehend eingefüllt.<br />
ACHTUNG:<br />
Keine Luftblasen einschließen! Zügig arbeiten, da die Lösung relativ rasch<br />
polymerisiert!<br />
Beide Sandwiches werden mit je 100 µl wassergesättigtem 1-Butanol überschichtet, damit<br />
sich kein Meniskus bildet. Die Polymerisation dauert ca. 30 Minuten. Durch leichtes<br />
Neigen der Gelgießkammer kann man feststellen, ob das Gel auspolymerisiert ist. Die<br />
® Martina Marchetti, TU Wien, Chemische Technologien und Analytik
7<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
restliche Trenngellösung lässt man im Becherglas auspolymerisieren.<br />
11. Wenn das Trenngel auspolymerisiert ist, wird das Butanol durch Umdrehen der Gelgießkammer<br />
und Spülen mit deionisiertem Wasser entfernt.<br />
Danach wird das Sammelgel nach dem obigen Pipettierschema zubereitet. Die Sammelgellösung<br />
wird mit einer Pasteurpipette in die beiden Sandwiches pipettiert, bis diese vollständig<br />
gefüllt sind. Danach wird sofort ein Kamm in jedes Sandwich eingeführt, wodurch<br />
die Auftragetaschen im Gel geformt werden. Markieren der Eintragtaschen auf der<br />
Glasplatte mit einem Marker.<br />
12. Nach ca. 30 Minuten ist die Polymerisation des Sammelgels beendet. Durch vorsichtiges<br />
Herausziehen des Kammes lässt sich feststellen, ob das Gel auspolymerisiert ist. Nun<br />
kann die Anpressschiene gelöst werden und die Sandwiches (bestehend aus einer<br />
Aluminiumplatte, einem Gel und einer Glasplatte, nicht zerlegen) werden aus dem<br />
Gelgießstand entfernt. Die übrigen Teile der Gelgießkammer werden mit Wasser<br />
gereinigt.<br />
ACHTUNG: Keine organischen Lösungsmittel, Säuren oder Basen zum Reinigen der<br />
Kammerteile verwenden!<br />
3.2 PROBENVORBEREITUNG<br />
Herstellen des Proteinmix:<br />
In einem frisches Eppendorfgefäß werden je 10 µL der ausgegebenen Einzelstandards<br />
(c = 1 mg/ml) gemischt.<br />
Denaturierung der Proben:<br />
In Mikroeppendorfgefäßen werden jeweils 10 µl der Proben (7 Proben: Standardproteine,<br />
Proteinmix, zu identifizierende Probe) mit 10 µl Denaturierungsmix gemischt und 5 Minuten<br />
am kochenden Wasserbad erhitzt.<br />
Nach dem Abkühlen werden die Proben mit der Tischzentrifuge abzentrifugiert.<br />
3.3 VORBEREITUNG DER ELEKTROPHORESE<br />
1. Die Sandwiches sind an der Elektrophoreseeinheit mit je 1 Klammer so anzubringen, dass<br />
die Glasplatten nach vorne weisen.<br />
2. Nun werden die Kühlschläuche angeschlossen und der Wasserhahn aufgedreht.<br />
3. Der 10-fach konzentrierte Elektrophoresepuffer wird mit destilliertem Wasser verdünnt<br />
(1 Teil + 9 Teile) und gut durchmischt.<br />
4. Die unteren Pufferkammern werden mit Elektrophoresepuffer so hoch gefüllt, dass die<br />
Sandwiches ca. 1 cm eintauchen. Die Kämme werden entfernt und soviel Laufpuffer in<br />
die oberen Pufferkammern (hinter den Sandwiches) gegossen, dass auch die<br />
Auftragetaschen gefüllt sind.<br />
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8<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
5. Jeweils 4-6 µL der denaturierten Standardproteine, des Standardproteinmixes bzw. der<br />
Probe werden vorsichtig in die Auftragetaschen eingebracht (siehe Abb. 7).<br />
Standardprotein-Mix<br />
Abb. 7: Mögliches Auftrageschema für Standardproteine und Probe.<br />
6. Der Deckel wird nun auf die Elektrophoreseeinheit aufgesetzt (er muss einrasten) und die<br />
Kabel werden an das Netzgerät angeschlossen (ACHTUNG: Farben beachten!).<br />
3.4 ELEKTROPHORESE<br />
Probe<br />
Enolase<br />
Myoglobin<br />
BSA<br />
1. Den Netzstrom des Power Supply an der Rückseite des Gerätes aufdrehen. Das Programm<br />
geht in den End-Modus.<br />
2. Um die Spannungswerte und Stromwerte einzugeben drücken Sie die SET/ENTER Taste<br />
am Gerät, um in den Programm-Modus zu gelangen. Das Spannungssymbol V leuchtet<br />
auf und der Wert für die Spannung blinkt. Durch drücken der Taste ↓/↑ stellen Sie die<br />
gewünschten Spannungen von 220 V ein. SET/ENTER drücken, um die Wahl zu<br />
bestätigen. Wenn der Spannungswert vom Anfang in Ordnung ist, einfach SET/ENTER<br />
drücken, um die Wahl zu bestätigen.<br />
3. Auf der Anzeige blinkt nun der zuletzt programmierte Stromwert. Durch drücken der<br />
Taste ↓/↑ stellen Sie den gewünschten Stromwert von 50 mA ein. SET/ENTER drücken,<br />
um die Wahl zu bestätigen. Wenn der Stromwert vom Anfang in Ordnung ist, einfach<br />
SET/ENTER drücken, um die Wahl zu bestätigen.<br />
4. Nun blinkt der Wert für die Zeit. Da Sie selbst entschieden werden wann das Gel fertig<br />
gelaufen ist, sollte dieser Wert auf jeden Fall größer als 20 Stunden gewählt werden.<br />
Durch drücken der Taste ↓/↑ stellen Sie den gewünschten Wert von 20 Stunden ein.<br />
SET/ENTER drücken, um die Wahl zu bestätigen. Wenn die Zeitangabe vom Anfang in<br />
Ordnung ist, einfach SET/ENTER drücken, um die Wahl zu bestätigen.<br />
5. Nach dem Programmieren drücken Sie RUN und starten die Elektrophorese. VIEW<br />
drücken um die aktuellen Spannungen, Stromwerte und die abgelaufene Zeit anzuzeigen.<br />
Notieren Sie Strom-Spannungswerte in regelmäßigen Abständen.<br />
Probe<br />
Conalbumin<br />
Carbonic Anhydrase<br />
Probe<br />
Standardprotein-Mix<br />
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9<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
6. Bevor der Frontmarker das Niveau des Puffers in der unteren Pufferkammer erreicht, wird<br />
der Lauf durch drücken der STOP Taste beendet. Der Lauf kann 30 min – 60 min dauern.<br />
Durch drücken der VIEW Taste werden die Endparameter angezeigt. Die Kabel werden<br />
abgesteckt, die Wasserkühlung abgedreht und der Deckel geöffnet.<br />
7. Nach Entfernen der Klammern werden die Sandwiches aus der Elektrophoresekammer<br />
herausgenommen und mit Wasser abgespült und die Glasplatten vorsichtig mit einem<br />
Messer oder einer Rasierklinge von den Gelen abgehoben. Die Sammelgele werden<br />
abgetrennt und verworfen. Zur Markierung der beiden Trenngele wird vom ersten Gel ein<br />
kleines Stück des oberen rechten Ecks und vom zweiten Gel das untere rechte Eck<br />
abgeschnitten.<br />
3.5 FÄRBUNG UND DETEKTION<br />
ACHTUNG: Färbe- und Entfärbelösung sparsam verwenden! Es genügt, wenn die Gele<br />
gerade mit Lösung bedeckt sind!<br />
1. Die beiden Trenngele werden in ein mit Färbelösung gefülltes Plastikgefäß transferiert.<br />
(ACHTUNG: Die Gele nur mit nassen Handschuhen angreifen, da sie sonst leicht<br />
zerreißen!)<br />
2. Die Färbung dauert etwa 30 min und die Plastikschale sollte manchmal leicht geschwenkt<br />
werden.<br />
3. Nach Abspülen mit Wasser werden die Gele im Entfärbebad I für 30min. Danach werden<br />
die Gele über Nacht im Entfärbebad II. Die Gele werden am nächsten Morgen eingescannt<br />
und per Email verschickt.<br />
3.6 AUSWERTUNG<br />
1. Bestimmung der Rf-Werte der einzelnen Proteine durch Ausmessen deren<br />
Wanderungsweiten im Trenngel relativ zu der des zugefügten Frontmarkers.<br />
2. Erstellung der Kalibrationskurve log MW gegen Rf-Wert.<br />
3. Ermittlung des Molekulargewichts des Probeproteins aus seinem Rf-Wert mit Hilfe der<br />
Kalibrierfunktion.<br />
Für die Erstellung der Kalibrierfunktion werden folgende Proteine verwendet:<br />
Standardprotein MW in kDa<br />
Conalbumin 78<br />
Rinderserumalbumin (BSA) 66<br />
Enolase 44<br />
Carbonic Anhydrase 23,3<br />
Myoglobin 16,9<br />
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4. PROTOKOLLIERUNG<br />
(i) Aufgabenstellung<br />
10<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
(ii) Elektrophoreseparameter u.a. :<br />
Gelkonzentration, Geldicke, Trenngelhöhe, Dauer der Separation,<br />
Strom/Spannungskurve, Standardproteine und deren Konzentrationen, absolute<br />
Proteinmenge am Gel, Detektion<br />
(iii) Kalibrierfunktion (log MW gegen Rf)<br />
(iv) MW des Probeproteins<br />
(v) Diskussion des Ergebnisse (nicht nur das MW ist ein Ergebnis!) und der analytischen<br />
Methode (Vorteile, Nachteile, Alternativen)<br />
5. REFERENZEN<br />
R. Westermeier, “Electrophoresis in Practice”, 3 rd Edition, Wiley-VCH<br />
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1. Geräte<br />
11<br />
PLATZINVENTAR<br />
1 Netzgerät EPS 301<br />
1 Hoefer SE 250 Elektrophorese-Apparatur inkl. 2 Wasserschläuche<br />
1 Hoefer Mighty Small SE 245 Dual Gel Caster<br />
1 Ultraschallbad<br />
1 Heizplatte<br />
1 Tischzentrifuge<br />
2. Zubehör<br />
2 Aluminiumoxidplatten<br />
4 Abstandhalter<br />
2 Glasplatten<br />
4 Klammern<br />
2 Kämme<br />
<strong>GELELEKTROPHORESE</strong> 2008<br />
Eppendorf Research Pipetten inkl. Spitzen:<br />
0.5 – 10 µL, 2 – 20µL, 100 – 1000µL, 500 – 5000 µL<br />
weiße, gelbe, blaue Spitzen, große weiße Spitzen in entsprechendem Steckbehältnis<br />
Eppendorfgefäße (1mL)<br />
Pasteurplastpipetten<br />
1 Glasstab<br />
1 Porzellanschale<br />
1 Plastikschale<br />
Bechergläser (3x 150 mL, 2x 500 mL, 1x 250 mL, 1x 100 mL, 1x 600 mL, 1x 800 mL)<br />
Messzylinder (1x 250 mL, 1x 100 mL)<br />
Plastikfolie (2 offene Seiten) zum Fotokopieren der Gele<br />
Gummihandschuhe (S, M, L)<br />
Wasserfester Marker (rot/schwarz)<br />
® Martina Marchetti, TU Wien, Chemische Technologien und Analytik